棘胸蛙歪头病病原分离·鉴定与药敏试验

李 明， 宋婷婷,郑荣泉,郑善坚*， 胡文芳,骆艺元，严 红

(1.浙江师范大学生化学院，浙江金华 321004; 2.浙江省金华市水产技术推广站，浙江金华 321000；3.浙江省绍兴市第一中学，浙江绍兴 312000)



棘胸蛙歪头病病原分离·鉴定与药敏试验

李 明1,2， 宋婷婷1,郑荣泉1,郑善坚1*， 胡文芳1,骆艺元3，严 红1

(1.浙江师范大学生化学院，浙江金华 321004; 2.浙江省金华市水产技术推广站，浙江金华 321000；3.浙江省绍兴市第一中学，浙江绍兴 312000)

摘要[目的]分离并鉴定棘胸蛙歪头病病原。[方法]从患歪头病棘胸蛙(Quasipaa spinosa)体内分离到致病菌，分别采用4种不同方式进行人工感染试验，通过形态观察、生理生化试验、16S rDNA测序等方法进行鉴定，并采用抑菌圈研究该菌株对12种抗生素的敏感性。[结果]除口服方式外，肌肉注射、皮肤损伤浸泡、皮肤不损伤浸泡感染途径均能使棘胸蛙发病并导致死亡，且对蛙有较强的致病性。通过生理生化试验和16S rDNA测序等方法鉴定致病菌为脑膜炎败血金黄杆菌(Chryseobacterium meningosepticum)。药敏试验结果表明：该致病菌对万古霉素、头孢哌酮、庆大霉素和红霉素高度敏感，而对吡哌酸、链霉素、四环素、诺氟沙星、青霉素、新霉素、林可霉素、先锋霉素不敏感。[结论]棘胸蛙歪头病病原为脑膜炎败血金黄杆菌。

关键词棘胸蛙；脑膜炎败血金黄杆菌；16S rDNA；药敏试验

Isolation, Identification and Drug Sensitivity Test of the Pathogen ofQuasipaaspinosa

LI Ming1,2,SONG Ting-ting1,ZHENG Rong-quan1, ZHENG Shan-jian1*et al (1.College of Chemistry and Life Science,Zhejiang Normal University,Jinhua,Zhejiang 321004; 2.Jinhua Fishery Technical Extension Station of Zhejiang Province,Jinhua,Zhejiang 321000)

Abstract [Objective] To isolate and identify the pathogen ofQuasipaaspinosa.[Method] Pathogenic bacteria were isolated fromQ.spinosa.Infection experiment was carried out by four different methods.Pathogenic bacteria were identified by morphologic observation,physiology biochemistry experiment,and 16S rDNA sequence.Sensitivity of strains to 12 antibiotics was researched by inhibition zone.[Result] Except oral administration,intramuscular injection,skin injury soaking,skin soaking without injury could all lead to the death ofQ.spinosa,and had relatively strong pathogenicity to frogs.Identification by biophysical and biochemical tests and 16S rDNA sequence showed that the pathogenic bacterium wasChryseobacteriummeningosepticum.Drug sensitive test showed thatC.meningosepticumwas highly sensitive to vancomycin,cefoperazone,gentamicin and erythromycin,but was not sensitive to pipemidic acid,streptomycin,tetracycline,norfloxacin,penicillin,neomycin,lincomycin and cephalothin.[Conclusion] The pathogenic bacterium ofQ.spinosawasC.meningosepticum.

Key wordsQuasipaaspinosa;Chryseobacteriummeningosepticum; 16S rDNA; Drug sensitivity test

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)主要分布于我国长江以南地区，是一种兼具食用和药用价值的蛙类[1]。但是，由于棘胸蛙养殖规模扩大、养殖密度提高和种质衰退等原因，棘胸蛙疾病种类和病害也相应增多，国内已报道了棘胸蛙的红腿病、烂皮病、黑肝病等10余种疾病，已成为困扰棘胸蛙养殖业发展的重要因素之一[2-6]。近年来，在棘胸蛙养殖区浙江省丽水、杭州等地区暴发了一种以歪头为主要特征的流行病，该病可以在不同阶段的棘胸蛙蛙群中流行，主要危害体质量100 g以上的大蛙，常发于变态以后，蝌蚪期偶见。病蛙皮肤发黑，在水面出现间歇性旋转，身体失去平衡力，游动时身体打转，腹部朝上，头部歪斜朝向一边，厌食懒动，应激能力差，与叶雪平等[7]报道的牛蛙脑膜炎(歪脖子病)疾病症状相似。该病传染性强，死亡率高，发病时间一般在7~10 月，水温在20 ℃以上，从发病到死亡一般为4~7 d。棘胸蛙歪头病以歪头为典型症状，死亡率高，对棘胸蛙养殖造成较大的危害。笔者从病蛙体内分离出致病菌，并通过形态观察、生理生化试验和16S rDNA测序确定致病菌为脑膜炎败血金黄杆菌。脑膜炎败血金黄杆菌是蛙类的常见致病菌，也称脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)或脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)，在牛蛙、美国青蛙上造成较大危害[8-11]。但是，脑膜炎败血金黄杆菌在棘胸蛙上发现报道尚属首次。笔者对浙江省丽水地区发生的棘胸蛙歪头病进行病原分离、鉴定及药敏试验，以期为棘胸蛙歪头病的诊断及有效防控提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物。患棘胸蛙歪头病的病蛙材料取自浙江省丽水某棘胸蛙养殖场；试验用健康棘胸蛙购自浙江省金华市婺城区绿谷清泉养殖合作社，平均体质量为(100±15)g/只。在实验室环境下饲养观察3 d后，用于试验。养殖试验期间，每天投喂鲜活黄粉虫1次，吸污换水1次，养殖用水为经曝气2 d的自来水，pH为7.2，水温(22±1)℃，养殖试验用水族箱为120 cm×60 cm×60 cm，水位5 cm，斜置木板架供棘胸蛙栖息。

1.1.2试剂。16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒，购自TaKaRa公司；细菌生化鉴定管、细菌药敏纸片，均购自杭州天和微生物制剂有限公司；其他试剂为实验室自配。

1.2方法

1.2.1致病菌分离。取典型歪头病濒死的棘胸蛙，体表用无菌水冲洗、75%乙醇消毒，无菌操作分别取病蛙的肝、肾、脑组织，划线接种于普通营养琼脂平板，于28 ℃条件下培养24 h，分别从肝、肾、脑平板上挑选优势菌落，纯化后暂标记为b-1、b-2、b-3。

1.2.2人工感染试验。

1.2.2.1菌液制备。将纯培养的3株细菌b-1、b-2、b-3，分别接种到营养肉汤液体培养基中，置于振荡频率为200 r/s的摇床中振荡培养18 h，使用灭菌生理盐水采用比浊管法稀释，配制成5×108CFU/mL浓度的菌液。

1.2.2.2人工感染。将3种制备菌液(浓度均为5×108CFU/mL)分别采用口服(试验I组)、肌肉注射(试验Ⅱ组)、皮肤损伤浸泡(试验Ⅲ组)、皮肤不损伤浸泡(试验Ⅳ组)4种方式感染棘胸蛙。具体感染方法如下：①口服，用灭菌长注射器将菌液按0.4 mL/只的剂量从口腔直接灌入食道；②肌肉注射，先对蛙体背部皮肤消毒后，将菌液按0.2 mL/只的剂量对健康蛙做肌注攻毒试验；③皮肤损伤浸泡，对蛙体背部皮肤用乙醇擦拭消毒后，用无菌针头划伤背部皮肤，置于5×108CFU/mL菌液中浸泡1 h；④皮肤不损伤浸泡，对蛙体体表用乙醇擦拭消毒后，置于5×108CFU/mL菌液中浸泡1 h。所有试验组人工感染后都转入已消毒的水簇箱中饲养。同时，设置2个对照组(对照组 Ⅰ 和对照组 Ⅱ)：对照组 Ⅰ 注射生理盐水，注射剂量为0.2 mL/只；对照组 Ⅱ 为未经处理的空白对照。每组随机取4只健康棘胸蛙，感染试验观察15 d。

1.2.3生理生化特性的测定 。对分离的细菌进行革兰氏染色和生理生化试验，生理生化试验按照杭州天和微生物试剂有限公司的生化管说明书进行。

1.2.416S rDNA鉴定。使用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒提取菌株的DNA，采用扩增细菌的PCR通用引物，正向引物F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物合成和PCR扩增产物测序均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。对致病菌使用16S rDNA的通用引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。将细菌的16S rDNA 基因序列与 GenBank 中已知核酸序列进行 Blast比对。

1.2.5药物敏感试验。药物敏感试验采用药敏纸片法。将分离菌株接种于营养肉汤培养基，于28 ℃下恒温振荡培养12 h，用灭菌生理盐水稀释为1×106CFU/mL，取200 μL菌液均匀涂布培养基表面，然后用镊子将药敏纸片贴在琼脂平板表面。于28 ℃恒温培养12~16 h后测量抑菌圈直径，参照杭州天和微生物试剂有限公司的药敏试验判断标准来判定结果。

2结果与分析

2.1病蛙症状从图1可以看出，病蛙外表皮肤发黑，头部歪斜朝向一边，厌食懒动，应激能力差,身体失去平衡力，游动时身体打转，并同时伴有部分白内障、肝坏死等症状。

图1　患病棘胸蛙的外部特征观察Fig.1　External characteristics of diseased Quasipaa spinosa

2.2病原分离结果从患歪头病的棘胸蛙肝、肾、脑组织中均分离到3株病菌b-1、b-2、b-3。分离的3株细菌的形态大小基本一致，革兰氏染色观察为阴性短杆菌，在培养基上形成的菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，微凸，不透明，微黄色。28 ℃培养24 h后，菌落直径为2～3 mm。

2.3人工感染试验结果由表1可知，除口服方式外，其他感染途径均能使棘胸蛙发病并导致死亡，且对蛙有较强的致病性。将b-1、b-2、b-3这3个菌株对健康蛙做肌注攻毒试验中，试验组蛙在4 d内100%发病死亡，其症状表现与自然发病基本相同，对照组全部存活，表明这3个菌株均为致病菌。

表1　分离菌对棘胸蛙的人工感染结果

2.4菌株鉴定结果

2.4.1生理生化鉴定。由表2可知，3个菌株的生化鉴定结果完全相同，根据《常见细菌系统鉴定手册》[12]和《一、二、三类水生动物疫病病种名录释义》[13]鉴定分离的病原菌株为脑膜炎败血金黄杆菌(Chryseobacteriummeningosepticum)。

2.4.216S rDNA测序与鉴定结果。通过1%琼脂糖凝胶电泳，获得约1 400 bp的条带。经测序，得到长度为1 381 bp 的DNA序列(图2)。

表2　3株分离菌的生理生化鉴定结果

注：-表示阴性；+表示阳性。

Note：- and + indicated negative and positive,respectively.

图2　致病菌16S rDNA的测序结果Fig.2　Sequencing results of pathogenic bacteris 16S rDNA

将该序列提交GenBank进行Blast比对，发现其与脑膜炎败血金黄杆菌的16S rDNA序列的同源性达到96%以上，因此鉴定该病原菌为脑膜炎败血金黄杆菌。

2.5药敏试验结果由表3可知，该致病菌对万古霉素、头孢哌酮、庆大霉素、红霉素高度敏感，而对吡哌酸、链霉素、四环素、诺氟沙星、青霉素、新霉素、林可霉素、先锋霉素不敏感。

3讨论与结论

张奇亚等[10]对脑膜炎败血金黄杆菌引起的美国青蛙旋游症进行病理组织切片观察，认为脑膜炎败血金黄杆菌可引起脑组织损伤和脑功能障碍，是导致打转旋游和头部歪斜的

表3　分离菌对12种抗生素的药敏试验结果

注：R表示耐药；S表示敏感。

Note:R was rug resistance;S was wensittivity.

主要原因。但是，引起蛙类歪头病的病原也不仅仅是脑膜炎败血金黄杆菌。杨春浩等[11]将美国青蛙的歪头病的病原鉴定为嗜水气单胞菌。在棘胸蛙中是否存在其他病原感染引起的歪头病症状，仍有待于进一步研究。

脑膜炎败血金黄杆菌有较强的耐药性。该试验中致病菌对12种抗生素的药敏试验结果表明，仅万古霉素、红霉素、头孢哌酮、庆大霉素4种抗菌药物对该菌有较好的抗菌作用。陈会波等[14]采用K-B纸片扩散法对牛蛙脑膜炎黄杆菌进行药敏试验，结果表明病原对40种试验药物耐药，而敏感药物仅5种。在此次试验的敏感药物中万古霉素、红霉素、头孢哌酮属于禁用药，不能用于棘胸蛙歪头病的治疗，只能选择庆大霉素作为治疗的药物。因此，在该病的防治上，应坚持防重于治，并积极探索生态预防和免疫预防的方法。

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收稿日期2015-12-30

作者简介李明(1974- )，男，浙江金华人，高级工程师，从事水产养殖技术推广研究。*通讯作者，副教授，硕士，从事水产病害学研究。

基金项目浙江省重大科技专项(2010C12008)；浙江省水产创新团队项目(2012R10026-07)。

中图分类号S 947.2

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)03-064-03