改进的双波长法测定二元混合体系中葡萄糖和木糖含量

朱 捷，葛奉娟，王欲晓

(徐州工程学院化学化工学院，江苏徐州 221111)



改进的双波长法测定二元混合体系中葡萄糖和木糖含量

朱 捷，葛奉娟，王欲晓

(徐州工程学院化学化工学院，江苏徐州 221111)

摘要[目的]采用改进的双波长法测定混合糖液中葡萄糖和木糖含量。[方法]采用分光光度法(Douglas法)对标准糖溶液的糖含量进行了测定，并对传统的双波长法的波长选择和标准曲线拟合进行了改进：通过误差分析确定测定波长，对木糖显色反应在550 nm处的标准曲线进行二次方程拟合，使其更适于低浓度木糖的检测。[结果]该方法可同时测定混合体系中葡萄糖和木糖的含量，总糖、木糖和葡萄糖测定的回收率均为94.00%~101.60%，准确度较高。[结论]该方法能满足植物纤维水解液中糖含量的常规分析要求。

关键词总糖；葡萄糖；木糖；双波长分光光度法

Detection of Glucose and Xylose in Duplex Mixture by Improved Dual-wavelength Spectrophotometry

ZHU Jie, GE Feng-juan, WANG Yu-xiao(School of Chemistry and Chemical Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou, Jiangsu 221111)

Abstract[Objective] To detect the accharide contents of glucose and xylose in duplex mixture by improved dual-wavelength spectrophotometry. [Method] Saccharide content in standard solution was detected by spectrophotometry (Douglas method). The wavelength selection and standard curve fitting were improved in traditional dual-wavelength method: Detection wavelength was detected by error analysis. Quadratic equation fitting of standard curve was carried out at 550 nm, which was more suitable for the detection of low-concentration xylose. [Result] This method could simultaneously detect the glucose and xylose contents in the mixed system. The recovery rates of total sugar, xylose and glucose were all between 94.00% and 101.60%, which had relatively high accuracy. [Conclusion] This method meets the demand of saccharide determination for plant fiber hydrolysis.

Key wordsTotal sugars; Glucose; Xylose; Dual-wavelength spectrophotometry

生化法生产纤维乙醇，也称第2代燃料乙醇，主要是利用木质纤维素原料中的各种糖组分经微生物发酵生产[1-4]。木质纤维素原料水解液中糖组分非常复杂，既含有戊糖(主要是木糖)又含有己糖(主要是葡萄糖)，它们的存在既有单体也有寡聚形式[5]。大多数天然发酵生产乙醇的微生物(如酵母菌和运动发酵细菌)只能利用葡萄糖单糖[6]。最近研发的基因工程菌可以利用戊糖(如木糖)和阿拉伯糖的单糖，有的可以利用纤维二糖发酵生产乙醇[7]。因此，对木质纤维素原料水解液中葡萄糖和木糖含量的测定非常重要。

常见的研究定量分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、分光光度法(比色法)、滴定法[8-14]。高效液相色谱法的优点是水解液中的混合糖组分都能定量分析(主要是葡萄糖和木糖)，但是此方法所用设备昂贵，分析操作和维护的成本都较高。气相色谱法也可以定量分析水解液中的混合糖组分，但需要衍生化，分析时间也较长。滴定法操作简单，成本低，但该方法的选择性较差，无法区分出混合组分中戊糖和己糖。

分光光度法是实验室分析糖组分的常用方法，而地衣酚-盐酸法利用戊糖与浓盐酸共热时降解转变为糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯(地衣酚)反应呈鲜绿色，采用比色法测定，可用于测定戊糖含量[15]；苯酚硫酸法利用浓硫酸将糖迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再采用比色法测定，可用于分析总糖含量[16]；DNS法，即二硝基水杨酸法，是利用碱性条件下二硝基水杨酸(DNS)与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显现棕红色，可以分析总还原糖含量[17]。但是，苯酚硫酸法和DNS法对己糖和戊糖的选择性不高，不能分别测定二者的浓度。地衣酚-盐酸法对己糖的响应极弱，是一种测定戊糖浓度的好方法，但无法测定己糖的浓度。植物纤维水解液中，戊糖以木糖为主，而己糖以葡萄糖为主。笔者选择Douglas法(间苯三酚-冰醋酸显色法)，并采用改进的双波长法同时测定混合糖液中木糖和葡萄糖的含量。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器。751型紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；水浴锅；电子天平；磁力加热搅拌器。

1.1.2试剂。间苯三酚；冰醋酸；无水乙醇；浓盐酸；葡萄糖；木糖。

1.2标准溶液的配制分别配制不同浓度的木糖和葡萄糖溶液，木糖浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L，葡萄糖浓度分别为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mmol/L。

1.3显色反应按照陈钧辉[17]的方法配制显色液。移取1 mL 1 mmol/L或2 mmol/L的木糖或葡萄糖标准溶液于试管中，加入10 mL显色液并摇匀，立即放入沸水浴中反应，10 min后取出试管，用流水冷却至室温，5 min后在分光光度计上进行全波长扫描。以空白样进行相同的显色反应，作为参比。确定测定波长后，移取1 mL标准溶液或待测溶液，按照上述步骤进行显色反应，在测定波长下测定其吸光度。

1.4测定波长的选择双波长法即测定2个波长下的吸光度，同时测出葡萄糖和木糖的浓度。其中，第1个测定波长通常选择木糖的最大吸收波长550 nm，而第2个测定波长的选择的方法并不统一[18-19]。因此，双波长法的本质是求解以下的二元方程组：

ε1c1+ε1′c2=A1

(1)

ε2c1+ε2′c2=A2

(2)

式中，c1和c2分别为木糖和葡萄糖的摩尔浓度，ε1和ε1′分别为木糖和葡萄糖在波长1时的摩尔吸光系数，ε2和ε2′分别为木糖和葡萄糖在波长2时的摩尔吸光系数，A1和A2分别为样品在波长1和波长2时的吸光度。这个方程组的求解并不复杂，因此对计算的简化并不是考虑的主要因素，应从误差分析上来考虑波长的选择。当吸光度的测量值因系统误差偏离了理论值ΔA(如0.001)时，测得的c1和c2的相对误差应尽可能小。

假定波长1为550 nm，假定葡萄糖在550 nm处的摩尔吸光系数ε1′近似为零(当葡萄糖浓度不是远大于木糖浓度时，此种近似是合理的)，则A1、A2的测定误差与c1的关系式为：

(3)

(4)

这说明木糖浓度的测定值与波长2的选择无关，仅仅与波长1(550nm)下吸光度A1测定的准确度有关。

A1、A2的测定误差与c2的关系式为：

(5)

(6)

葡萄糖浓度的测定误差除了与A1、A2的测定准确度有关外，还与葡萄糖的浓度以及2种糖在波长2时的吸光系数有关。样品中葡萄糖浓度越小，A1和A2对葡萄糖浓度测定结果的影响就越大，这由混糖样品(或水解液)本身的性质决定。然而，吸光系数则可以通过选择波长来达到预期误差最小的目的。最理想的波长选择是使得ε2/ε2′和1/ε2′同时达到最小。因此,通对葡萄糖和木糖溶液在不同波长下显色反应的吸光度进行了误差分析，并选择了最佳的第二波长。

1.5标准曲线的绘制以糖浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，按直线或二次曲线规则拟合出标准曲线，并根据标准曲线计算出待测样品的糖浓度。

1.6回收率的计算分别测定3份混合糖样品(样品1：木糖5mmol/L，葡萄糖1mmol/L；样品2：木糖1mmol/L，葡萄糖5mmol/L；样品3：木糖0.5mmol/L，葡萄糖2.5mmol/L)的糖浓度，并按照以下公式计算回收率：回收率(%) = 实测糖浓度/理论糖浓度×100。

2结果与分析

2.1双波长法第二波长的确定从图1可以看出，在550nm处木糖的吸收达到最大值，同时在550nm处葡萄糖的吸收几乎为零，因此选择550nm作为双波长法测定的第一波长。最理想的第二波长选择使得ε2/ε2′和1/ε2′同时达到最小。因为ε2/ε1小于1，所以A2的误差对葡萄糖浓度c2的影响更为明显。由表1可知，在405nm处ε2/ε2′达到最小值，在400nm处1/ε2′达到最小值。因此，选择400nm为双波长法测定的第二波长。

注：1.木糖浓度为1 mmol/L；2.木糖浓度为2 mmol/L；3.葡萄糖浓度为1 mmol/L;4.葡萄糖浓度为2 mmol/L。　Note：1. 1 mmol/L xylose; 2. 2 mmol/L xylose; 3. 1 mmol/L glucose 1; 4. 2 mmol/L glucose. 图1　不同浓度的葡萄糖和木糖溶液的显色反应光谱 Fig. 1　Spectra of glucose and xylose solutions at various concentrations

Table 1The values of ε2/ε2′ and 1/ε2′ within the wavelength of 390-420 nm

波长Wavelengthnmε2/ε2'浓度为1mmol/L浓度为2mmol/L1/ε2'浓度为1mmol/L浓度为2mmol/L3900.6670.57513.88912.5003950.6570.58214.28612.6584000.6450.58013.15812.3464050.6220.57113.51412.9874100.6380.59614.49313.6994150.7780.67718.51915.7484200.9360.88221.27721.505

此外，标准曲线的方程为A=εc+b，当截距b较大时不可忽略，因此式(1)和(2)在更精确测定时应更正为：

ε1c1+b1+ε1′c2+b1′=A1

(7)

ε2c1+b2+ε2′c2+b2′=A2

(8)

然而，这并不会影响波长选择的结果。

2.2标准曲线木糖和葡萄糖在400和550 nm处的标准曲线方程分别为：y=0.044 6x和y=0.211 4x+0.223 4；葡萄糖在400和550 nm处的标准曲线方程分别为：y=0.068 4x-0.003 4和y=0.003 9x-0.003 5。

其中，木糖在400 nm处的标准曲线以及葡萄糖在400和550 nm处标准曲线的截距很小，可以忽略不计。但是，木糖在550 nm处的标准曲线有很大的截距。这也说明用式(7)替换式(1)是必要的。

当拟合直线关系时，R2约为0.99。从图2可以看出，标准曲线的截距较大，在测量低浓度的木糖样品时(浓度小于 1 mmol/L)会造成很大的误差。同时，高浓度时试验点向低值偏移。从图3可以看出，用二次函数得到拟合曲线的R2达到0.999 5，且截距明显减小。

2.3方法的精度和准确率评价从表2可以看出，在木糖浓度不太低时，样品浓度的测定结果令人满意，回收率为94%~102%。但当木糖的浓度低至0.5 mmol/L时，测定结果出现明显偏差，说明该方法不适于低浓度木糖的测定(小于1 mmol/L)。

图2　木糖的标准曲线(一次曲线)Fig.2　The standard curve of xylose (linear curve)

图3　木糖的标准曲线(二次曲线)Fig.3　Standard curve of xylose (quadratic curve)

样品编号Samplecode总糖Totalsaccharide理论浓度Theoreticalconcentrationmmol/L实测浓度Measuredconcentrationmmol/L回收率Recoveryrate∥%木糖Xylose理论浓度Theoreticalconcentrationmmol/L实测浓度Measuredconcentrationmmol/L回收率Recoveryrate∥%葡萄糖Glucose理论浓度Theoreticalconcentrationmmol/L实测浓度Measuredconcentrationmmol/L回收率Recoveryrate∥%16.006.04100.675.005.10102.001.000.9494.0026.005.9699.333.002.9698.673.003.00100.0033.002.8996.330.500.1428.002.502.75110.00

注： 木糖在550 nm处的显色反应标准曲线选取一次标准曲线。

Note：Linear standard curve was selected for the standard curve of xylose chromogenic reaction at 550 nm.

用木糖在550 nm处的二次标准曲线，重新计算了3种混糖样品的浓度。由表3可知，当木糖浓度较大时，用一次标准曲线测定的回收率较好，而当木糖浓度较低时二次标准曲线对总糖、木糖和葡萄糖的回收率分别为96.7%、96.0%和96.8%，明显好于一次标准曲线。

忽略葡萄糖显色反应在550 nm的吸光度，样品1、2使用木糖的一次标准曲线，样品3使用木糖的二次标准曲线，计算回收率。由表4可知，即使在葡萄糖浓度为木糖5倍的情况下，对测定结果的影响依然是很小的。

用该方法测定了稻杆的硫酸和盐酸的水解液，并进行了加标回收率试验。前者加入2 mmol/L的葡萄糖溶液，后者加入2 mmol/L的木糖溶液。由表5可知，该方法对加标样品的测定有较高的准确度，可用于植物纤维水解液的糖含量测定。

表3　回收率的测定结果(2)

注：木糖在550 nm处的显色反应标准曲线选取二次标准曲线。

Note：Quadratic standard curve was selected for the standard curve of xylose chromogenic reaction at 550 nm.

表4　回收率的测定结果(3)

注：测定中忽略葡萄糖显色反应在550 nm处的吸收。

Note：Absorption at 550 nm was neglected in glucose color reaction.

表5　样品加标回收率的测定结果

3结论

笔者采用改进的双波长法测定了混糖溶液中木糖和葡萄糖的含量，并对方法的回收率进行了测定，得出以下结论：①选择550和400 nm作为测定波长，可以使测定误差尽可能小； ②对于木糖在550 nm处标准曲线的拟合，选择二次方程拟合标准曲线有更宽的适用范围，尤其适合测定木糖浓度较低的溶液；③葡萄糖显色反应在550 nm处的吸光度要远小于木糖，除非混糖溶液中葡萄糖的浓度远大于木糖，不必考虑葡萄糖在550 nm处的吸收；④在合适的木糖标准曲线选择下，中配制的几种混糖样品的总糖、木糖和葡萄糖测定的回收率均为94.00%~101.60%，对加标样品的测定也有较高的准确度，说明该方法可以实现对总糖、木糖和葡萄糖含量的准确测定。

参考文献

[1] HIMMEL M E，DING S Y，JOHNSON D K，et al.Biomass recalcitrance：Engineering plants and enzymes for biofuels production[J].Science，2007，315：804-809.

[2] GOLDEMBERG J.Ethanol for a sustainable energy future[J].Science，2007，315：808-810.

[3] 雷齐玲.燃料乙醇技术研究现状和发展趋势分析[J].广州化工，2015(5)：42-43.

[4] 陈瑜琦，王静，蔡玉梅.发展燃料乙醇和生物柴油的碳排放效应综述[J].可再生能源，2015(2)：25-27.

[5] NILSSON C，ASPLUND A，SCHAGERLÖF H，et al.Studies of the separation and characterisation of mixtures of starch and cellulose derivatives by use of chromatography and mass spectrometry[J].Anal Bioanal Chem，2007，387：2045-2055.

[6] 王周芳，陈明，王冰冰，等.基因重组酵母发酵木糖产酒精的研究[J].林产化学与工业，2007，27(3)：33-36.

[7] 鲍晓明，沈煜.植物纤维原料全糖乙醇发酵菌株选育[J].生物产业技术，2008(5)：49-57.

[8] 李芳，胡容峰，黄丽丹，等.高效液相色谱-蒸发光散射法测定黄芪中单糖和双糖的含量[J].安徽中医药大学学报，2015(2)：82-84.

[9] 刘玉峰，李黎，李东.高效液相色谱法测定食品中的单糖、双糖[J].食品科学，2007，28(3)：293-296.

[10] 胡长平.液相色谱法对糖类的测定[J].安徽化工，2005，134(2)：57-58.

[11] 位杰，吴翠云，蒋媛，等.蒽酮法测定红枣可溶性糖含量条件的优化[J].食品科学，2014(24)：136-140.

[12] 郑雪红，郑爱榕，陈祖峰.气相色谱法分析海洋胶体多糖中的单糖组成[J].分析测试学报，2004，23(4)：58-60.

[13] 杨绍祥，吕艳羽，刘永国，等.聚葡萄糖中还原糖含量测定方法研究[J].食品科学技术学报，2014(2)：72-75.

[14] 于立芹，范毅，陈玲，等.TLC与GC法则测定红薯叶多糖的单糖组成[J].河南科学，2011，29(2)：150-152.

[15] 李昊力，李家林，张雪飞.地衣酚-盐酸法测定燕麦β葡聚糖中的戊聚糖含量[J].广东化工，2014(17)：179-180.

[16] 何晋浙，邵平，倪慧东，等.灵芝多糖结构及其组成研究[J].光谱学与光谱分析，2010，30(1)：123-127.

[17] 陈钧辉.生物化学实验[M].4版.北京：科学出版社，2012.

[18] 迟聪聪，张曾，柴欣生，等.用双波长可见光谱快速测定半纤维素提取液中糖的含量[J].光谱学与光谱分析，2010，30(4)：1084-1087.

[19] 段永忠，唐湘华，慕跃林.双波长法测定二元混合体系中戊糖的含量[J].生物技术，2009，19(1)：44-46.

收稿日期2015-12-07

作者简介朱捷(1979- )，男，江苏徐州人，讲师，博士，从事农作物废弃物的有效利用方面研究。

基金项目江苏省高校自然科学基金项目(12KJD530002)。

中图分类号O 657.3

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)03-009-04