HPLC法测定大鼠血浆中槐定碱

高 华，纪红燕，邓　宁，杜　伟，费平霞，孙维红，党宏万，文友民(宁夏医科大学总医院药剂科，银川750004)



HPLC法测定大鼠血浆中槐定碱

高 华，纪红燕，邓宁，杜伟，费平霞，孙维红，党宏万，文友民*(宁夏医科大学总医院药剂科，银川750004)

摘要：目的建立HPLC法测定大鼠血浆中槐定碱的体内分析方法，并用于其药动学研究。方法以苦参碱为内标，血浆样品在1.0 mol·L-1氢氧化钠碱性条件下加入1.0 mL三氯甲烷液-液萃取，采用Synergi 4 μHydro-RP 80A(150 mm×4.6 mm，4.0 μm)色谱柱分离，流动相为乙腈-磷酸盐缓冲溶液(0.01 mol·L-1KH2PO4，磷酸调pH 3.00)=5∶95，流速为1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长210 nm，在此条件下测定。采用DAS 2.0软件进行药动学参数估算。结果槐定碱在0.25～25 μg·mL-1内线性良好(r=0.999 7)，提取回收率为76.6%~90.4%，日内、日间精密度符合要求。槐定碱主要药动学参数t1/2、AUC、Cmax分别为1.75± 0.66 h、10.80± 2.69 mg·h·L-1和5.56± 0.78 mg·L-1。结论该方法快速、灵敏、 专属性强，可用于槐定碱药的代动力学分析。

关键词：槐定碱；高效液相色谱法；药代动力学

槐定碱(sophoridine)是从宁夏特色药材苦豆子中分离出的单体生物碱，具有抗肿瘤、抗心律失常、抗炎、镇痛、抗病毒和免疫抑制等作用[1-3]。研究发现，

槐定碱对白血病细胞株、表皮癌株有抑制作用，而且抑瘤作用具有较强的选择性。此外，临床上也发现槐定碱能够单独治疗一些恶性肿瘤，如恶性淋巴瘤、消化道肿瘤和恶性滋养细胞肿瘤等，是一种高效低毒的抗癌生物碱[4]，具有重要的临床开发应用价值。本研究旨在建立简单、快速的HPLC法，以探讨槐定碱在大鼠体内的药代动力学过程，期望通过本实验为槐定碱的进一步研究以及临床应用和后续制剂研发提供方法参考和实验依据。

1仪器与材料

1.1仪器1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括G1322A型脱气机，G1311A型泵，G1329A型自动进样器，G1316A型柱温箱和G1314B型紫外检测器；HPD-25无油隔膜真空泵(天津市达因仪器厂)；5804R台式低温冷冻离心机(美国eppendorf公司)；SI-0246涡旋混合仪(美国SI公司)；OS-SYS氮吹仪(美国Organomation公司)。

1.2试药槐定碱(质量分数>99.5%，宁夏紫荆花制药有限公司，批号 121080)；苦参碱(质量分数为100.0%，中国药品生物制品检定所，批号 110805-200508)；甲醇、乙腈为色谱纯(Fish Scientific 公司)；KH2PO4、NaOH、CCl4均为分析纯；实验用水为双蒸水。

1.3动物 健康SD大鼠，雌雄各半，鼠龄11～12周，体质量为300±20 g，购买于宁夏医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(宁)2014-0003。SPF级环境饲养，饲养条件为相对湿度40%～70%，室温22～28 ℃。预养1周后进行实验。实验动物的使用通过了宁夏医科大学总医院伦理委员会的论证。

2方法与结果

2.1溶液的配制

2.1.1槐定碱标准溶液的配制 精密称取10.27 mg槐定碱对照品，置于10 mL量瓶中，用纯水溶解，定容至刻度，摇匀，得到1 mg·mL-1的储备液Ⅰ。以流动相为稀释溶液，逐步将储备液Ⅰ稀释成100 μg·mL-1的储备液Ⅱ。置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.1.2内标溶液苦参碱溶液的配制 称取1.01 mg苦参碱对照品，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，得到100 μg·mL-1的苦参碱溶液。以甲醇为稀释液，逐步稀释得到质量浓度为1.00 μg·mL-1的苦参碱溶液，置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.2色谱条件 色谱柱：Synergi 4 μHydro-RP 80A(150 mm×4.6 mm，4.0 μm)；保护柱：ZORBAX SB-C18(4 mm×2.0 mm，5 μm)；乙腈-0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液=5∶95(磷酸调节pH至3.0)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为210 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

2.3血浆样品的预处理精密吸取血浆100 μL，置于2 mL EP管中，精密加入苦参碱溶液(1.0 μg·mL-1)100 μL，涡旋混匀后加入1.0 moL·L-1氢氧化钠溶液20 μL，涡旋震荡1 min，加入三氯甲烷1.0 mL，涡旋震荡1 min，以4 000 r·min-1离心5 min，取下清溶液，55 ℃空气流，吹干。100 μL流动相将残渣溶解，涡旋混匀30 s后，以14 000 r·min-1高速离心10 min，取10 μL上清液进样分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法专属性 取大鼠空白血浆、含槐定碱+内标苦参碱溶液的血浆、大鼠静脉注射给药后的血浆样品，按照2.3项下方法处理，考察血浆中有无干扰物的存在，并考察该方法的专属性。各组样品的HPLC色谱图见图1。从图1中可以看出样品的测定不会受血浆中内源性物质的干扰，在当前色谱条件下，槐定碱和内标苦参碱的峰形良好，保留时间分别为5.5和6.4 min，峰形对称，专属性良好。

图1HPLC图

a.空白血浆；B. 苦参碱+槐定碱；C.大鼠给药后的血浆样品；1.苦参碱；2.槐定碱

Fig.1 HPLCchromatograms

a. blank plasma；B. matrine + sophoridine；C. plasma sample 1. matrine 2. sophoridine

2.4.2 标准曲线及检测限 取槐定碱对照品溶液以大鼠空白血浆为稀释溶液，配成质量浓度为0.25，0.5，1.25，2.5，5.0，12.5和25.0 μg·mL-1的槐定碱血浆样品，按照2.3项下方法处理，进样10 μL。以槐定碱与内标物峰面积比(Y)对槐定碱的药物质量浓度(X)进行线性回归。槐定碱血浆标准曲线为：Y=0.584 5X- 0.029 1(r=0.999 7，权重系数=1/X)，其线性范围为0.25~25.0 μg·mL-1，0.25 μg·mL-1为槐定碱的最低检测质量浓度。

2.4.3 精密度及相对回收率取100 μL大鼠空白血浆，配制成质量浓度为0.5，2.5和20.0μg·mL-1的槐定碱血浆样品，每个质量浓度6个样品，按照2.3项下方法操作，每个浓度样品测定3 d。计算其日间、日内精密度与相对回收率，结果见表1。

2.4.4绝对回收率 取100 μL大鼠空白血浆，配制成质量浓度为0.5，2.5和20.0 μg·mL-1的槐定碱血浆样品，每个浓度6个样品，按照2.3项下方法操作，另用流动相配制相同浓度的槐定碱对照品，各6份，按照2.2项下操作，取10 μL进样分析，以血浆样品测定的峰面积与同质量浓度的对照溶液峰面积的比值，计算绝对回收率，结果见表1。

表1槐定碱的日内、日间精密度与回收率

Tab.1 Intra-day and inter-day precision and recovery of sophoridine

(n=6)

2.4.5稳定性采用大鼠空白血浆配制质量浓度为0.5，2.5和20.0 μg·mL-1的槐定碱标准血浆样品，各6份，按照2.3项下方法操作，考察血浆样品室温放置4 和12 h，置于-70 ℃保存12 d以及样品经历3次冻融后的稳定性。结果表明，在不同的存放条件下，RSD值均小于15.0%。

2.5 槐定碱大鼠体内药动学考察 SD大鼠，雌雄各半，禁食12 h，自由饮水。取5只大鼠尾静脉注射给予槐定碱溶液10 mg·kg-1，在给药后0.08，0.17，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0和8.0 h分别从大鼠眼眶后静脉丛取血500 μL，置于含肝素的离心管中，以14 000 r·min-1离心10 min，取200 μL，按照2.3项下方法操作并测定其血药质量浓度，绘制血药质量浓度-时间曲线，结果见图2。采用DAS 2.0软件对所有数据进行处理并计算其药代动力学参数，结果见表2。

图2 槐定碱平均血药质量浓度-时间曲线

Fig.2 Mean plasma concentration-time profiles of sophoridine

表2槐定碱的主要药动学参数

Tab.2 The main pharmacokinetics pharameters of sophoridine

参数x±sAUC(0～t)/mg·h·L-110．80±2．69AUC(0～∞)/mg·h·L-112．80±2．77MRT(0～t)/h1．62±0．43MRT(0～∞)/h1．56±0．71t1/2z/h1．75±0．66tmax/h1．97±0．63CLz/L·h-1·mg-10．81±0．19Cmax/mg·L-15．56±0．78

3 讨论

本实验以大鼠作为研究对象，采用HPLC法建立测定大鼠体内槐定碱血药浓度的方法。大鼠尾静脉注射给予槐定碱后，血药浓度下降很快，随后下降速度变慢，体内过程符合二室模型，动力学行为符合线性动力学过程[5]。实验结果与王羚郦等[6]在小鼠体内药物代谢动力学研究的结果相符合。

在血浆样品的预处理中，弱碱性药物在碱性条件下，采用有机溶剂进行提取，可以使血浆样品中的内源性杂质较少，干扰小。故本实验在碱性条件下，选用氯仿溶液进行液-液萃取，其提取回收率较高,符合实验的测定需要。该测定方法取样量少、操作简单、专属性强，能够满足槐定碱药动学研究的要求。

参考文献：

[1]杨巧丽，顾政，黄华.中药苦豆子的研究进展[J].西北药学杂志，2011，26(3): 232-234.

[2]李凯，王银兰，朱会琴. HPLC法测定苦豆子总碱中3种生物碱的含量[J].西北药学杂志，2004，19(2):53-54.

[3]杨泽云，黄九英，魏玲，等. 槐定碱药理作用研究进展[J].九江学院学报，2011， 26(2):51-54.

[4]李雪梅，吴运光，潘达鑫，等.新型抗肿瘤药槐定碱[J].中国新药杂志，2006，15(8):654-657.

[5]吴永江，陈建军，程翼宇. 液-质联用研究槐定碱、槐果碱和苦参碱在兔体内的药代动力学[J].分析化学，2005，33(11):1627-1630.

[6]王羚郦，王素军，曾洁，等. 槐定碱在小鼠体内药物代谢动力学的研究[J].中南药学，2014，12(5):442-444.

Determination of the concentration of sophoridinein rat plasma by HPLC

GAO Hua，JI Hongyan，DENG Ning，DU Wei，FEI Pingxia，SUN Weihong，DANG Hongwan，WEN Youmin*(Department of Pharmacy，General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination of sophoridinein rat plasma by HPLC and to study its characteristics of pharmacokinetics. Method Sophoridine and internal standard matrine were extracted from rat plasma with liquid-liquid extraction，then were separated on a Synergi 4 μ Hydro-RP 80A(150 mm×4.6 mm，4.0 μm) column with a mobile phase consisted of acetonitrile and phosphate buffer(pH 3.00) (5∶95) at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 210 nm，and the column temperature was 30 ℃. The pharmacokinetic parameters were calculated with DAS 2.0 practical pharmacokinetics program. Results The assay was linear in the range of 0.25～25 μg·mL-1( r=0. 999 7) with recoveries ranged from76.6% to 90.4% and satisfied inter- and intra- day precision. The parameters of t1/2，AUC，Cmaxfor sophoridine were 1.75±0.66 h，10.80±2.69 mg·h·L-1and 5.56±0.78 mg·L-1，respectively. Conclusion The developed method was specific, rapid and sensitive, and can be used for the determination of sophoridine inpharmacokinetic study.

Key words:sophoridine；HPLC；pharmacokinetics

(收稿日期：2015-07-02)

*通信作者：文友民，男，主任药师

作者简介：高华，男，主管药师，硕士研究生

基金项目：宁夏医科大学青年基金项目(编号：XQ2012012)

中图分类号：945

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)02-0183-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.021