植物光合碳同化途径关键酶基因研究

徐明怡，柴春荣，钟海秀，倪红伟

（黑龙江省科学院自然与生态研究所，湿地与生态保育国家地方联合工程实验室，哈尔滨 150040）



植物光合碳同化途径关键酶基因研究

徐明怡，柴春荣，钟海秀，倪红伟

（黑龙江省科学院自然与生态研究所，湿地与生态保育国家地方联合工程实验室，哈尔滨 150040）

摘要：植物按照碳同化方式的不同可分为C3途径、C4途径和CAM途径。C4植物通过长期的进化形成了特有的高效光合基因。在高温、高光强和低CO2浓度等条件下，C4植物的光合速率较C3植物更高。本文阐述了高等植物光合碳同化途径中PEPC、PPDK、NADP-ME、RCA、SBPase 5个关键酶基因研究进展。

关键词：C4途径；C3途径；PEPC；PPDK；NADP-ME；RCA；SBPase

高等植物的光合碳同化类型主要有3种：C3途径，C4途径和景天酸代谢途径（CAM）。C3植物固定CO2的酶为1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPCase）。C4植物是从C3植物进化而来的一种高光效种类。在高光强、高温及低CO2浓度下，与C3植物相比，C4植物具有保持较高光效的能力。C4植物固定CO2的酶与C3植物不同，为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC），PEPC对CO2的亲和力高于C3植物中RuBPCase。在C4植物中，有很多酶类被涉及参与到C4光合碳同化途径，PEPC、PPDK和NADP-ME是3个最为关键的酶。目前这3种酶已经被研究得较为透彻，已从许多C4植物物种中分离出这3种关键酶，并分别将它们导入了不同种类的C3植物中，获得较大进展，结果令人满意。

1　PEPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）

PEPC是C4植物光合碳同化途径的关键酶之一，叶肉细胞的细胞质中含有该酶。目前，许多植物物种的pepc基因都已被成功克隆。20世纪80年代，大肠杆菌（E.coli）、蓝藻（Cyanobacterium）、谷氨酸棒杆菌（C. glutanicum）、黄花菊属（Flaveria）、冰叶日中花（M. Crystallinum）、玉米（Z.mays）等物种的pepc基因就已被相继克隆。20世纪90年代，科学家们又成功克隆出一批农作物的pepc基因，如大豆（G.max）、马铃薯（S. tuberosum）、高粱（S.vulgare）、水稻等。

C4植物中的pepc基因家族有C4型（绿叶型）、根（茎）型、黄化叶型或C3型这三种类型，它们有着相似的基本结构，已经从高粱、玉米、黄花菊属植物中克隆出pepc基因的3个家族成员的DNA或cDNA。Izui等［1］对玉米pepc基因进行研究，发现三种类型的pepc基因位于不同染色体上，C4型pepc基因位于9号染色体上，根型pepc基因在4号或5号染色体上，C3型pepc基因则在7号染色体上。

无论是生理学家还是育种学家，都对玉米的C4型pepc基因表现出极大的关注。与黄花菊属多基因编码的C4型pepc基因不同，玉米和高粱的C4型pepc基因是单基因编码的。最先克隆出来的是玉米和Flaveria trinervia（黄花菊属）中的C4型pepc基因的cDNA，随后一些农作物，如甘蔗和谷子的C4型pepc基因也被克隆。将高粱的C4型pepc基因的编码区序列与玉米的进行同源性比较，发现有88%的序列具有同源性，而与大肠杆菌进行比较，则仅有40%～50%的序列表现出同源［2］。对玉米C4型pepc基因的cDNA序列进行深入分析，发现C末端区域有大量的保守序列，推测部分的酶催化位点存在于该区域［3］。其他学者对玉米叶片的C4型pepc基因的一级结构进行推测，认为其C末端区域含有相对保守的片段，N末端则含有可变片段，并且认为这两个片段中可能分别含有活性中心和调节位点［4］。Jiao等［5］明确指出，N末端存在玉米PEPC的磷酸化位点（Ser-15），位于13～21片段中；C末端则含有活性中心的赖氨酸残基（Lys-606）。

研究人员也对高粱的pepc基因进行了研究，发现高粱叶片中含有E-PEPC型和G-PEPC型这两种类型［6］，认为高粱的pepc基因不同于其他pepc基因家族类型，其显著特征表现在基因表达水平上，而不是它的一级结构。除了不同组织器官和生长发育时期对pepc基因的表达有影响外，光照也会对其表达水平产生影响。

不同的基因编码不同的pepc基因类型。有两个不同的机制对高等植物的PEPC活性进行调控：一是通过位于N末端附近的保守丝氨酸残基发生可逆蛋白磷酸化对PEPC活性进行调控。另一个机制是各种代谢因子会对PEPC活性产生抑制，如苹果酸、葡萄糖-6-磷酸、谷氨酸、天冬氨酸等。此外，苹果酸可以抑制C4型PEPC磷酸化，将C4型pepc基因转入C3植物后，内源的胞质NADP-ME可能会被pepc基因过表达而诱导出较高的活性，从而使得苹果酸抑制PEPC活性的能力降低，大大提高了PEPC对PEP的亲和力。

2　PPDK（磷酸丙酮酸二激酶）

Hatch和Slack［7］最先发现C4植物中能够将丙酮酸催化转化成PEP的酶是PPDK。PPDK存在于叶肉细胞的叶绿体里，负责将运回叶肉细胞的Pyr催化，重新形成CO2受体PEP。这个反应是限制C4光合碳同化途径速度的关键步骤，因此，PPDK成为C4途径中另一个被广泛研究的关键酶。光可以准确调控C4植物叶片中PPDK的活性。无光照条件下，PPDK活性下降；有光照射叶片时，其活性会迅速升高［8］。

目前研究发现，ppdk基因有两个类型的家族成员，即C4型和胞质型。两种类型的ppdk基因之间存在部分重叠［9］。它们是由两个启动子控制，从同一个基因的两个不同起始位置开始转录。

大量研究证实，C3植物在逆境下长期驯化，进化出了C4植物。因此，C3植物与C4植物的ppdk基因同源性极高，只是在表达方式上存在着较大的差异。C3和C4植物的ppdk基因都有双启动子系统，这是它们的共同特征。它们的区别是第一个启动子可以调控C4植物的ppdk基因进行表达，第二个启动子是负责调控C3植物ppdk基因表达。研究人员已经从不同物种的各种组织器官中将多种ppdk基因克隆出来，包括C4植物、细菌、C3植物、原生动物和CAM植物等。

植物的生长环境会对ppdk基因的表达产生影响。Reiskind［10］的研究发现，C3植物在低CO2浓度条件下，有一些类似C4植物的光合碳同化特征可以被诱导出来，使得CO2补偿点降低，光呼吸强度减弱。Agarie等［11］对荸荠（Eleocharis）的研究认为，陆生条件下，荸荠进行C4植物的光合作用，ppdk基因的表达按照C4型进行；水生条件下，则按照C3植物的碳同化方式固定CO2，ppdk基因则按照C3植物进行表达。这表明，尽管陆生的ppdk1和水生的ppdk2具有极高的同源性，但却是不完全一样的。PPDK1蛋白是由cDNA的核序列编码的蛋白质。它有一个可能作为叶绿体转移肽的特殊N端区，但是PPDK2蛋白却没有这个特殊区域，因此ppdk1和ppdk2编码了两种蛋白。叶绿体PPDK1是由ppdk1负责编码，细胞质PPDK2则由ppdk2编码。荸荠这种两栖类植物进化出了独特的光合特征，这种进化方式为揭示C4植物光合碳同化途径的基因表达机理提供了极具参考价值的重要依据。

3　NADP-ME（依赖于NADP的苹果酸酶）

NADP-ME型C4植物的光合碳同化途径的另一个关键酶存在于维管束鞘细胞的叶绿体中，它是NADP-ME，已经从玉米、高粱和黄花菊属植物中克隆出了C4型NADP-ME基因的cDNA。玉米和高粱的C4型me基因核酸序列具有最高的同源性，其同源性达到89%。高粱的me基因核酸序列与C3型的拟南芥仅有40%的同源性，同源性最低。玉米的叶片中NADP-ME同工酶有两种，分别为62KD和72KD［12］；黄花菊属中除了有62KD和72KD两种NADP-ME同工酶外，还有一种为64KD的同工酶［13］。从玉米基因组中找到了3个与NADP-ME编码序列或活性有关的位点。3号染色体的me3位点定位的是玉米叶片NADP-ME的cDNA；me1位点是定位的是胚芽鞘中的me基因，该位点与其在胚芽鞘中的累积有关，但不能与me3位点的叶片me基因的cDNA杂交；me2位点位于6号染色体长臂上，该位点定位的可能是一个玉米根中的me基因［14］。对黄花菊属植物Flaveria进行研究发现，该植物具有3个me基因，me1、me2，其余的可能负责编码叶绿体细胞质中的NADP-ME。me1基因仅在叶片中表达，光可以对它的表达进行调控，其表达方式会影响它的C4光合特征；me2基因则在叶片和根中都会表达，但是表达量较低。因此有学者认为me1基因负责编码C4型的NADP-ME，me2基因则可能是负责编码“管家”型NADP-ME［15］。

4　RCA （Rubisco活化酶）

所有光合生物进行光合碳同化的关键酶都是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶 （Rubisco）。它负责催化RuBP的羧化和加氧反应，并且能够对两者之间的关系进行调节。植物的碳同化效率是由RuBP的羧化和加氧两个反应的比值来决定的。

为了提高RuBP的羧化和加氧反应的比值，可以对Rubisco进行改造，以此来增强Rubisco固定CO2的效率。虽然Rubisco在叶片中的含量很高，大约占50%叶片可溶性蛋白，但其催化效率却极低。研究发现，Rubisco为钝化态时必须经过活化才能具有羧化/加氧活性，能够活化钝化态Rubisco的这种酶就是Rubisco活化酶（RCA）。而Rubisco的活化程度能够决定叶片的碳同化效率，是碳同化过程中的关键因子，因此，对RCA的研究极为重要。近年来，已对RCA的生理生化和分子生物学展开了研究，成为植物光合作用的重要研究领域之一。Martinez等［16］对高产玉米种群的Rubisco进行研究，发现高产玉米种群中有较高的RCA蛋白含量，因而使得Rubisco活性提高。 Jiang等［17］也发现超级稻的高产品种中Rubisco活性和RCA含量要高于普通水稻品种。这表明，RCA的含量和活性可以在一定程度上影响作物产量。科研人员已经从一些植物中成功克隆了rca基因，其蛋白提纯和活性检测以及rca基因的表达方面的研究取得了重大突破。

RCA是一种具有ATPase活性的可溶性的叶绿体蛋白，是由核编码的蛋白质。RCA一般是由2个亚基构成，a亚基45kD，b亚基41kD，如拟南芥、菠菜、水稻、小麦、大麦、棉花等植物都有a亚基和b亚基。但是不同种类的植物，其RCA亚基的种类和数量也不相同，如衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、烟草和玉米，这3种植物的RCA就只有b亚基而没有a亚基。但不管是同种植物还是不同植物，它们的RCA亚基抗体之间都可以相互交叉反应。

RCA只能在含有叶绿体的组织器官中发生表达。有学者对植物的不同绿色组织做了相关研究。发现RCA可以在拟南芥绿色的茎、叶、花、果实中表达，但在拟南芥黄化苗和根中却检测不到它的表达。此外，在水稻的茎、叶和苹果叶片中，也发现RCA是可以表达的。这与Liu等［18］提出的Rubisco仅在含有叶绿素组织中出现特异表达的结论相一致。

5　SBPase（景天庚酮糖-1，7-二磷酸酯酶）

卡尔文循环中的另一个关键酶就是景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶（SBPase，EC 3.1.3.37）。它主要负责SBP的脱磷酰基作用，使CO2的受体RuBP再生。SBPase控制着Calvin循环中碳源的流向，因为它位于Calvin循环中同化和再生两个阶段的分支点上。尽管植物体内该酶的含量很低，但是决定了碳元素的流通方向，是继续进行循环再生成RuBP还是离开循环进入淀粉生物合成途径［19］，它能使碳同化和淀粉生物合成之间达到平衡［20］。

SBPase的前体是具有N末端延伸的信号肽，其在细胞质中合成，可以引导SBPase从细胞质进入叶绿体［19］。SBPase是核编码蛋白，对其氨基酸序列分析研究，发现SBPase有很高的同源性。不同植物的SBPase同源性可以达到80%左右，保守区域的同源性也较高，约为90%，成熟蛋白的同源性更高，可以达到98%以上。

光可以诱导SBPase的催化活性对其进行调节，并可以对其表达量进行调控［21］。研究发现，黑暗条件下，SBPase不具有催化活性［21］，通过光合作用中产生的还原力可以调控它的光活化［22］。光活化可以在很短的时间内完成，并且再度处于黑暗时，其活性又可被钝化［24］。

SBPase的活性除了受到光的诱导和调控外，还会被Mg2+浓度调控，SBPase作用底物SBP-Mg2+浓度变化，SBPase的活性也随之变化。此外，基质的pH值、SBPase反应产物S7P及甘油酸盐也会对SBPase的活性起到调控作用［25］。

有人认为SBPase具有更高级更复杂的调控方式。SBPase、GAPDH、PRKase及Fd这些酶形成了多酶复合体，一同定位在类囊体膜上，并具有一定功能。它们之间通过相互作用来提高酶的活化速率，从而使各酶之间对光诱导和光/暗变换形成了协调一致的适应，以此来保证酶的活化速率是最大的［26］。另外，不同发育时期，如不同叶龄和不同叶位的叶片，SBPase对碳同化会产生不同影响。还有研究表明，即使同一叶片但不同位置的SBPase，其表达量也是有所差异的。

目前，小麦、菠菜、桑树、拟南芥、水稻等许多植物物种的SBPase基因均已被成功克隆。人们希望通过分子生物学手段可以更深入地研究SBPase是如何调节植物的光合作用，以此验证改变SBPase催化能力是否可以对植物光合效率起到促进作用。

6　展望

C4光合途径中涉及基因协同表达，过程复杂。目前研究人员仅将C4高光效基因转入C3植物中，但对这些转入基因表达调控的研究很少。此外，酶活性还可能受到共价修饰、底物和协同因素的相互作用［27］，因此，在C3植物中引入真正的C4循环将最终需要对于叶片的组织学结构做出相应的改变。

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中图分类号：Q945.11

文献标志码：A

文章编号：1674-8646（2016）10-0001-05

收稿日期：2016-03-28

基金项目：黑龙江省院所基本应用技术研究专项“CO2倍增条件下三江平原小叶章光合蛋白分析及相关基因功能验证研究”；黑龙江省科学院科学研究基金项目“不同CO2浓度条件下三江平原小叶章比较蛋白质组学研究”

作者简介：徐明怡（1982-），女，黑龙江哈尔滨人，助理研究员，博士，主要从事植物分子生态学研究。

通讯作者：倪红伟（1964-），男，黑龙江双城人，研究员，博士，主要从事湿地生态学、生物多样性科学、恢复生态学等研究。

Study on the key enzyme genes of carbon fixation in photosynthetic organisms in plants

XU Ming-yi， CHAI Chun-rong， ZHONG Hai-xiu， NI Hong-wei
（Institute of Natural Resources and Ecology， HAS.， National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation， Harbin 150040， China）

Abstract：According to CO2assimilation mechanisms， plants can be classified into three types such as C3， C4， and CAM. C4plant acquired a series of high performance photosynthetic genes in evolution，which confers to more efficient photosynthesis than C3plant under adverse conditions such as high photo-intensity，temperature，and low CO2concentration.The research progress about five key enzyme genes in carbon fixation in photosynthetic organisms were expounded.

Key words：C4； C3； PEPC； PPDK； NADP-ME； RCA； SBPase