慢性低氧肺动脉高压大鼠肺部PPARγ表达变化的意义

向光明，刘焰



慢性低氧肺动脉高压大鼠肺部PPARγ表达变化的意义

向光明1,2，刘焰1△

摘要：目的探讨过氧化物酶增殖物激活受体γ（PPARγ）在慢性低氧肺动脉高压（HPAH）大鼠模型肺部及血管中的变化及意义。方法雄性SD大鼠40只，随机分为正常（NC）组、1周低氧（HC-1w）组、2周低氧（HC-2w）组、3周低氧（HC-3w）组。NC组于常氧条件下饲养于通风动物笼中3周，其余低氧组动物在每日9：00—17：00（8h/d）放入一体化低氧舱（O2体积分数10%）中进行低氧处理，时间分别为1周、2周、3周。右心导管法检测平均肺动脉压（mPAP），右心室收缩期末压力（RVSP）；解剖心脏计算右心室肥厚指数RV/(LV+S)。HE染色观察各组肺部中小动脉的形态学改变，计算血管壁厚百分比（WT%），Western blot方法检测肺组织中PPARγ蛋白表达水平。结果HC各组大鼠mPAP、RVSP、RV/(LV+S)血流动力学指标均较NC组明显升高（P < 0.05）。血管形态学显示HC各组相对于NC组，血管壁明显增厚，血管腔变狭窄，且随着时间延长，狭窄和增厚的程度加深。PPARγ在HC各组的表达与NC组相比均呈明显下降趋势，且随着时间延长，下降趋势更加明显。结论PPARγ对慢性低氧肺动脉高压的发生和发展有着重要的意义。

关键词：高血压,肺性；缺氧；过氧化物酶增殖物激活受体γ；大鼠, Sprague-Dawley；低氧性肺动脉高压

因此，PPARγ可能在呼吸系统生理和呼吸系统疾病中扮演重要的角色。本研究观察PPARγ在慢性低氧肺动脉高压大鼠肺部表达变化，尝试阐述其病理机制。

1　材料与方法

1.1材料健康雄性SD大鼠40只，200～250 g，由三峡大学医学院实验动物中心提供。低氧舱（OxyCyclermodel A84XOV，美国Biospherix公司），Nikon&Spot图像采集处理系统（日本Nikon公司），RM-6280多道智能生理信号记录系统（成都仪器厂），兔抗大鼠PPARγ多克隆抗体、兔抗大鼠βactin多克隆抗体、山羊抗兔多克隆抗体（美国genetex公司），DAB显色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠HPAH模型的建立将40只大鼠按随机数字表法分为4组，每组10只：正常组（NC），1周低氧（HC-1w）组，2周低氧（HC-2w）组，3周低氧（HC-3w）组。HC各组每天9:00—17:00（8h/d）进入一体化低氧舱（O2体积分数10%）中进行低氧造模处理，正常组饲养于通风常氧动物笼内。在造模期间，各组大鼠均给予充足的食物和水自由摄取。

1.2.2血流动力学测定在1周末、2周末分别检测HC-1w组、HC-2w组大鼠血流动力学，3周末检测HC-3w组和NC组大鼠血流动力学。将大鼠做颈部正中切口，分离皮下组织及肌肉后暴露出右颈外静脉，使用一直径1mm聚乙烯塑料微导管内装肝素溶液（生理盐水＋肝素10 U/mL）缓慢进入其中，另外一端连接压力感受器。注意生理记录仪压力波形变化及导管进入深度，判断导管前端位置。导管途经上腔静脉依次进入右心房、三尖瓣口、右心室，直至肺动脉干，长度大约进入3.5～4.0 cm。待波形稳定3～5min后测量平均肺动脉压（mPAP）及右心室收缩期末压力（RVSP）。记录完毕后，处死大鼠，剪取心脏，剪去心房组织，分离出右心室（RV）和左心室+室间隔（LV+S）后滤纸吸干，称RV和LV+S质量，计算右心室肥厚指数RV/（LV+S）。

1.2.3肺动脉形态学指标观察剪取右肺组织块，甲醛固定，石蜡包埋、连续切片及HE染色，选取显色较好，弹力层清晰的直径小于150 μm中小肺动脉(15 μm＜管径＜150 μm)。于400倍光镜下观察形态变化。图像采集处理系统分析计算血管壁厚百分比（WT%），公式：（外弹力膜直径－内弹力膜直径）/外弹力膜直径×100%。获取的大鼠动脉图片采用随机数字表法随机分组，每组大鼠测量8～10个中型肺动脉及小型肺动脉取其均值。

1.2.4蛋白印迹检测PPARγ的表达变化冰上匀浆肺部组织块，加裂解液后4℃条件下12 000 r/min离心取上清分装，BCA蛋白含量测试盒测定各组细胞总蛋白浓度。各组上样30 μg总蛋白，SDS-PAGE电泳2h后转PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液封闭1h，加入1∶400稀释兔抗大鼠β-actin，1∶200稀释兔抗大鼠PPARγ，4℃孵育过夜后TBST溶液洗涤10min×3次，1∶5 000稀释山羊抗兔二抗，室温孵育2h TBST液洗涤10min×3次。利用化学发光ECL试剂显影，并曝光扫描拍照，用Quantity One软件分析各组条带中PPARγ蛋白的相对表达，分析其与内参蛋白β-actin的比值。

1.3统计学方法采用sigma plot软件进行统计学分析。计量数据用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较用SNK-q法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组血流动力学指标比较NC组、HC-1w组、HC-2w组、HC-3w组的mPAP、RVSP和RV/(LV+S)依次增高，组间比较差异均有统计学意义（均P< 0.05），见表1。

Tab.1　Comparison ofmPAP, RVSP and index of right ventricularhypertrophy between four groups表1　各组mPAP、RVSP和右心肥厚指数比较（n=10,±s）

Tab.1　Comparison ofmPAP, RVSP and index of right ventricularhypertrophy between four groups表1　各组mPAP、RVSP和右心肥厚指数比较（n=10,±s）

＊P < 0.05，＊＊P < 0.01；a与NC组比较，b与HC-1w组比较，c与HC-2w组比较，P < 0.05；表2同；1mmHg=0.133 kPa

NC组HC-1w组HC-2w组HC-3w组F 16.4±3.1 20.1±2.8a27.4±3.3ab39.1±2.4abc117.415＊＊28.8±2.0 32.9±1.9a39.3±4.5ab47.3±3.8abc61.594＊＊24.1±4.3 29.7±2.9a33.8±4.5ab38.7±3.4abc26.141＊＊

2.2肺动脉形态学指标的变化NC组小动脉血管内膜光滑完整，血管壁不厚，肌层无明显增厚，外膜无增生及纤维化表现。HC-1w组血管内膜开始不光整，血管壁稍增厚，肌层及外膜轻微增生及纤维化。HC-2w较HC-1w组血管重塑程度加深。HC-3w组血管明显重塑，内膜不光滑，管壁增厚，管腔狭窄，肌层及外膜增生明显，纤维化严重。NC组、HC-1w组、HC-2w组、HC-3w组的WT%依次增高，组间比较差异均有统计学意义（均P<0.05）见图1、表2。

Fig.1　Pulmonary arterymorphological changes in four groups of rats图1　各组大鼠肺动脉形态学变化（HE染色，×400）

Tab.2　Comparison of WT% and PPARγ expression between four groups表2　各组WT%和PPARγ蛋白表达比较（n=10，±s）

Tab.2　Comparison of WT% and PPARγ expression between four groups表2　各组WT%和PPARγ蛋白表达比较（n=10，±s）

组别NC组HC-1w组HC-2w组HC-3w组F WT% 8.8±0.4 11.6±2.5a13.7±2.7ab15.8±2.2abc19.293＊PPARγ 0.84±0.05 0.71±0.09a0.54±0.08ab0.23±0.04abc34.341＊

2.3各组PPARγ的表达变化比较NC组、HC-1w组、HC-2w组、HC-3w组的PPARγ表达依次降低，且随着时间延长，降低趋势更加明显，组间比较差异均有统计学意义，见表2、图2。

Fig.2　Expression of PPARγ protein in four groups图2　各组PPARγ蛋白表达

3　讨论

肺动脉高压（pulmonary arterialhypertension, PAH）并非一个单独的疾病，而是多种原因诱发引起的一类综合征，发病机制尚未完全明确。HPAH在肺动脉高压分类中属第三大类，HPAH的病理变化首先是异常的肺血管收缩（hypoxic pulmonary vaso⁃constriction,HPV），主要是在低氧环境中肺部血管不规则痉挛[4]，但是间断甚至持续的HPV无疑会极大加重右心负荷[5]，促进产生肺血管重塑（pulmonary ar⁃tery remodeling,PAR）。持续的低氧造成血管内皮的损伤，各种生长因子和血管活性物质分泌失调，外加血流动力学紊乱对血管的物理性冲击，肺动脉各层可出现异常细胞增殖凋亡及迁移现象[6-7]。肺中小血管处于缺氧环境加重HPV，反过来HPV加重PAR进一步加重缺氧，造成恶性循环，直至右心衰竭乃至全心衰竭，机体死亡[8-9]。

既往研究证明PPARγ在血管的重塑和增加血管通透性方面有重要作用[10]。PPARγ受体激动剂通过PI3K/Akt/NO信号通路可显著改善血管内皮依赖性舒张功能。PPARγ的天然配体或者人工合成配体都可与内皮上的PPARγ结合，PPARγ一旦被激活，可抑制一氧化氮合成酶[11]、清道夫受体A基因和血栓素合成酶基因转录与表达，阻止血管内皮细胞的增殖、迁移，减弱内皮素的分泌，从一定程度上弱化血管重塑[12]。PPARγ还可以对单核细胞趋化蛋白（MCP-l）及其受体CCRZ的转录进行抑制，减缓巨噬细胞向血管炎症部位聚集。同时抑制白细胞介素（IL）-6、IL-8和肿瘤坏死因子（TNF）-α等炎症因子，全面减轻血管损伤后的炎症反应[13]。PPARγ标志性激动剂罗格列酮已经在PAH动物实验中运用，证实对HPAH有一定积极疗效，且PPARγ阻断剂GW9662可显著阻断罗格列酮的作用，为HPAH的临床防治提供了新的思路[14]。本实验发现，随着低氧时间延长，大鼠肺部PPARγ表达下降，提示PPARγ在HPAH动物模型中的表达和低氧密切相关，PPARγ的表达可能是HPAH新的治疗靶点。但是PPARγ如何具体地在低氧肺血管重塑中发挥作用，离体实验是否有同样趋势，都是以后值得深入研究的问题。

参考文献

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（2015-06-07收稿2015-08-17修回）

（本文编辑李国琪）

The significance of PPARγ expression in lung tissue of rats withhypoxic pulmonaryhypertension

XIANG Guangming1,2, LIU Yan1△
1 Basicmedical College, Wuhan University, Wuhan 430071, China; 2 Institute of Respiratory Disease, China Three Gorges University, Yichang Central People′shospital△Corresponding Author E-mail:liuyan@whu.edu.cn

Abstract:Objective To investigate the significance of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)γ expression in the lung tissue of rats with chronichypoxic pulmonaryhypertension (HPAH).Methods Fortymale Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (n=10 for each group): normal control group (NC),hypoxia control group-one-week (HC-1w),hypoxia control group-two-week (HC-2w) andhypoxia control group-three-week (HC-3w).Normal control group was raised under normal oxygen condition in ventilated animal cage for three weeks.The otherhC groups were placed in a low oxygen chamber (O2concentration of 10%) from 9：00 AM-5:00 PM (8h/d) everyday by one week, two weeks and three weeks.Themean pulmonary arterial pressure (mPAP), right ventricular systolic pressure (RVSP) were detected.The index of right ventricularhypertrophy RV/(LV+S) wasmeasured by dissecting ratheart.Themorphological changes of the small pul⁃monary arteries were observed byhE staining, and the percentage of vascular wall thickness (WT%) was calculated.The ex⁃pression level of PPARγ protein was detected by Westren blot assay.Results ThemPAP, RVSP and RV/(LV+S) were sig⁃nificantlyhigher inhC groups than those of NC group (P<0.05).Themorphology of pulmonary arteries showed vessel wall thickening and vessel lumina stenosis inhC groups compared with that of NC group.The PPARγ expression in lung tissue was significantly lower inhC groups than that of NC group, and the downward trend wasmore obvious with the extension of time.Conclusion PPARγ plays an important role in the occurrence and development of chronichypoxic pulmonaryhyper⁃tension.

Key words:hypertension, pulmonary; anoxia; PPAR gamma; rats, Sprague-Dawley;hypoxic pulmonary arteryhyper⁃tensionbook=57,ebook=62低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary arteryhy⁃pertension,HPAH）主要病因为高原疾病或肺部疾病诱发的慢性持续缺氧状态。近年来，随着空气污染及雾霾的严重，肺部基础疾病如慢性阻塞性肺疾病（COPD）等继发性缺氧疾病明显增加，HPAH发病率和死亡率有所上升。HPAH患者疗效差，成为呼吸内科的临床难点问题之一[1]。过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR）是一类包含PPAR-α、β/δ和γ 3种亚型的核转录因子超家族，为异质二聚体，其隶属于维甲酸X受体[2]。PPARγ在呼吸道上皮、呼吸道平滑肌、肺部血管内皮及支气管黏膜下层均有不同程度的表达。PPARγ可抑制血管平滑肌增殖，影响血管内皮功能及内皮素-1（endothelin-1,ET-1）分泌[3]。

通讯作者△E-mail：liuyan@whu.edu.cn

作者简介：向光明（1968），男，副主任医师，主要从事呼吸衰竭研究

基金项目：湖北省自然科学基金指导性计划项目（2014CFC1037）

中图分类号：R563

文献标志码：A

DOI:10.11958/59062

作者单位：1武汉大学基础医学院（邮编430071）；2三峡大学呼吸病研究所，宜昌市中心人民医院