肠道病毒71型感染动物模型的应用与局限

吴月明，朱耐伟，朱勇喆

1.第二军医大学微生物学教研室，上海 200433; 2.第二军医大学海军医学系学员5队，上海 200433



·综述·

肠道病毒71型感染动物模型的应用与局限

吴月明1,2,*，朱耐伟1,*，朱勇喆1

1.第二军医大学微生物学教研室，上海 200433; 2.第二军医大学海军医学系学员5队，上海 200433

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是一种被忽视的热带传染病——手足口病的主要病原体之一，过去15年在亚太地区引起了多次手足口病暴发。由于脊髓灰质炎病毒的有效控制，EV71已成为最重要的嗜神经肠道病毒，其严重的神经系统并发症威胁着儿童健康。合适的动物模型可帮助更好地了解EV71神经致病机制，并有利于开发有效的疫苗和治疗药物。本文就EV71已建立的3类主要动物模型(非人灵长类动物模型、小鼠适应性模型及转基因小鼠模型)的特征、应用与局限进行综述。

肠道病毒71型；动物模型；应用与局限

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)为手足口病的主要病原体之一，是一种被忽视的热带传染病[1]。EV71属于小RNA病毒科，含有4种结构蛋白，分别为VP1、VP2、VP3和VP4。VP1可识别和结合宿主细胞表面受体蛋白。根据VP1核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C 3个基因型[2]。

EV71感染可引起持续发热、腹泻、皮疹、无菌性脑膜炎和脑炎，少数危及生命，如脑干脑炎、急性弛缓性麻痹[3]、自主神经系统失调和肺水肿等[4-5]。自1969年在美国加利福尼亚州首次发现EV71，其在全世界至少引起12次手足口病暴发[6]。20世纪90年代末EV71在马来西亚和中国台湾地区暴发，主要感染儿童，导致严重的神经系统并发症[6-7]。此后，亚太地区包括中国台湾地区、马来西亚、越南、新加坡、日本和中国大陆，经历了多次EV71相关手足口病疫情[8]。根据中国国家卫生和计划生育委员会报道，2015年我国共有2 014 999例患者确诊为手足口病，死亡124例[9]。

目前，EV71感染动物模型包括非人灵长类动物模型、小鼠适应性模型及转基因小鼠模型，已用于研究EV71的发病机制、疫苗与药物研发，但尚未建立一种可涵盖人类EV71感染各方面的模型。有些模型缺乏表面效度(与人类症状的相似度)，有些模型则缺乏构念效度(与人类病因的相似度)[10]。目前的动物模型各有优缺点，非人灵长类动物模型可用于评价EV71的神经毒力，小鼠适应性模型可用于研究疾病的发病机制及防治，而转基因小鼠模型则有助于了解病毒的生物学特性及其与宿主的相互作用。

1　非人灵长类动物模型

自20世纪90年代末EV71相关手足口病疫情暴发后，非人灵长类动物模型被用来评估和检测EV71的神经毒力。研究表明，食蟹猴、恒河猴和长尾黑颚猴均可被EV71感染[11-12]。

Nagata等[13-14]将EV71通过髓内和静脉感染食蟹猴，表现出锥体束损伤(弛缓性麻痹等)和锥体外系损伤(震颤和共济失调等)，且病毒抗原广泛分布于脊髓、脑干、小脑皮质、齿状核及大脑。食蟹猴的神经病理特征与重症EV71脑炎患者的病变相一致[15-17]，提示食蟹猴的中枢神经组织对EV71的易感性与人相似。

Zhang等[18]使用EV71阜阳分离株感染成年恒河猴，引发中枢神经系统感染和外周神经病变所致的神经元损伤。该模型建立了EV71系统性感染过程和病理变化，揭示了EV71的病毒血症动力学、免疫反应、组织病理学变化及神经元和外周神经的病变。该模型经颅内感染可引起肺水肿和肺门出血，是第1个能模拟EV71在非自然宿主中引起肺水肿的动物模型。

Liu等[19]通过气管内注入EV71感染恒河猴婴猴，其四肢与口部出现手足口病样丘疹和水疱。恒河猴婴猴的炎症反应与成年恒河猴类似，主要发生于气管和肺部。病毒聚集在恒河猴婴猴的延髓和下丘脑中，但未引起与食蟹猴类似的神经系统症状。有研究表明[20]，恒河猴婴猴不仅可作为手足口病的动物模型，还可评价EV71灭活疫苗的疗效。

Koroleva等[21]使用EV71保加利亚临床分离株感染长尾黑颚猴，致其瘫痪，并出现与儿童神经感染相似的神经系统症状。同时，EV71感染长尾黑颚猴可引起典型的脑干脑炎和脊髓灰质炎。因此，长尾黑颚猴可用于研究EV71引起的神经系统症状。

EV71对食蟹猴具有广泛的嗜神经性。不同毒力的毒株感染食蟹猴后，在神经毒力方面没有显著差异，因此该模型不适于评估病毒的神经毒力[13-14]。食蟹猴的症状与人类有所不同，并不出现皮肤损伤和肺水肿。虽然所有EV71亚型均证实对食蟹猴具有神经毒力，但尚未明确该模型是否可用于评价减毒活疫苗变异株的神经毒力[10]。

成年恒河猴感染EV71后可引起中枢神经系统感染及肺部炎症和肺水肿，但未能引起皮肤疱疹性病变及典型的神经系统症状[18]。恒河猴婴猴感染EV71后可引起手足口病皮肤疱疹性病变，但不能造成典型的神经系统症状，如弛缓性麻痹及共济失调等[19]。

综上所述，非人灵长类动物模型的组织亲嗜性、病毒复制部位和临床症状在不同灵长类动物之间存在明显的不同，且由于道德和经济问题很难广泛应用。

2　小鼠适应性模型

Wang等[10]将EV71台湾临床分离株EV71/4643分别经颅内、静脉、腹腔、口服感染2周龄以内和3～6周龄的BALB/c小鼠、C3H/HeN小鼠和ICR小鼠，发现小鼠对EV71的易感性呈年龄依赖性。同时，将EV71/4643毒株连续4次传代建立小鼠适应毒株(EV71/MP4)，再通过口服感染7日龄小鼠致其后肢瘫痪，在脊髓和脑干处发现神经元消失和凋亡。该研究表明，EV71/MP4毒株具有强烈的嗜神经性，能引起持续性感染，并诱发脑部炎症和弛缓性麻痹。

Chua等[22]在新生BALB/c小鼠颅内接种第6代EV71/MP-26M毒株，分别经肌内、颅内或腹腔感染1日龄和7日龄BALB/c小鼠，小鼠均出现四肢瘫痪，其中VP1突变(G145E)可增加EV71/ MP-26M在小鼠体内的毒力。

Ong等[23]将EV71/AY207648(B3亚型)毒株在1日龄ICR小鼠脑内数次传代，该适应毒株可感染2周龄ICR小鼠，并通过外周运动神经进入中枢神经系统引起脑膜炎。

Wang等[24]在小鼠骨骼肌4次传代建立小鼠肌肉适应毒株(Fuyang-0805a)。该毒株具有嗜肌肉性，可诱发骨骼肌和心肌的重度坏死性肌炎，1日龄ICR小鼠腹腔感染后可引起肠炎。

为避免小鼠适应性毒株的嗜神经性和嗜肌肉性等自然嗜性，Khong等[25]利用非适应毒株(临床分离株EV71/5865/SIN/00009)经腹腔和口服感染2周龄AG129小鼠〔α/β干扰素(interferon α/β，IFN-α/β)和IFN-γ受体缺陷小鼠〕，可引起神经系统症状。Yao等[26]将EV71临床分离株(EV71/58301，C4亚型)经腹腔感染21日龄长爪沙鼠，引起瘫痪、共济失调等神经系统症状。这两种模型的临床表现和组织病理学特点与Wang等[10]和Chua等[22]的小鼠适应模型相似。

目前尚未建立有效的成年小鼠模型。虽然在小鼠体内数次传代分离的病毒可增加EV71临床分离株的毒力，但小鼠适应性毒株并不能感染免疫力正常的非乳鼠小鼠。同时，小鼠适应性毒株具有明显的嗜肌肉性，改变了EV71感染引起的神经病变，并不能完全模拟人类感染的病理变化。

3　转基因小鼠模型

2009年确定了两种EV71人类受体：人类P-选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1；CD162)[27]和清道夫受体B2(scavenger receptor class B,member 2，SCARB2)[28]。PSGL-1是唾液黏蛋白的膜蛋白，仅在骨髓、白细胞和血小板中表达。SCARB2又称为溶酶体完整膜蛋白Ⅱ，主要定位于溶酶体，广泛表达于人体组织和细胞。

Liu等[29]建立人PSGL-1转基因小鼠，但该模型只对小鼠肌肉适应性毒株FY0805/MP10易感，并不能感染EV71临床分离毒株(C4亚型)。

Lin等[30]建立人SCARB2转基因小鼠。EV71(B亚型)感染小鼠后产生手足口病样症状，并引起1日龄小鼠瘫痪，但不能感染2周龄以上的小鼠。与野生型小鼠相比，该小鼠模型更易产生中枢神经系统症状、肢体瘫痪和死亡，且年龄依赖性和病毒复制部位等感染特征与野生型小鼠相似。

Fujii等[31]用人的表达谱(如中枢神经系统的神经元细胞、肺泡壁细胞、肝细胞和肠上皮细胞)建立人SCARB2转基因小鼠。6周龄以上的小鼠仍对EV71临床分离株易感。该模型的神经病变和临床特征(如共济失调、瘫痪和死亡)与人类、灵长类动物及野生型小鼠类似。Arita等[32]在3周龄的非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID)转基因小鼠脑中将病毒3次传代获得EV71(NOD/SCID)毒株。该毒株能使3～4周龄的NOD/SCID小鼠瘫痪。Caine等[33]在成年免疫缺陷小鼠A129(IFN-α/β受体缺陷小鼠)和AG129(IFN-α/β和IFN-γ受体缺陷小鼠)中建立EV71小鼠适应性毒株。该毒株可造成10周龄的AG129小鼠瘫痪，致死率达100%。Liao等[34]用EV71临床分离株(EV71/F23)感染NOD/SCID小鼠和stat-1敲除小鼠，均能引起瘫痪、脾纤维化、肌肉溶解和死亡。在NOD/SCID小鼠中，EV71抗原VP1主要聚积在肌肉中；而在stat-1敲除小鼠中，则表现为嗜神经性，EV71主要位于中枢神经系统。EV71感染NOD/SCID小鼠后引起的细胞因子变化与人类相似，可用于研究EV71感染引起的炎症变化。

PSGL-1是EV71受体，但神经元细胞不表达PSGL-1，人PSGL-1转基因小鼠模型仅可造成短暂的胃肠道感染，不能引起神经系统症状。人SCARB2转基因小鼠对EV71易感，但该小鼠模型不能模拟人类的所有症状，且发病机制与人类有差异[10]。肺水肿是重症EV71感染的标志，但转基因与野生型小鼠模型均未能诱发肺水肿，从而限制了这些小鼠模型在EV71发病机制中的研究。

4　结语

现已建立的3类EV71感染动物模型在应用领域中各有侧重。非人灵长类模型可用于研究EV71的系统性感染过程，加深人们对EV71感染途径、临床表现、病理学、病毒分布和免疫反应的了解。此外，灵长类模型更适用于评估EV71疫苗的免疫原性，并可用于检测小鼠模型中不能获得的疫苗指标。小鼠适应性模型对阐明EV71感染机制及研发疫苗、药物起重要作用[35]。新生小鼠在天然免疫方面尚未成熟，并不能完全模拟人类感染的机制与特点，因此仍需进一步研发小鼠非适应性毒株可感染的成年小鼠模型。目前仅确定了两种EV71受体，探寻所有EV71受体、共同受体及研发表达所有上述受体的转基因小鼠也是一条可行之路。

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.ZHU Yongzhe,E-mail: zhuyongzhe1984@sina.com

Applications and limitations of animal models in enterovirus 71 infection

WU Yueming1,2,*， ZHU Naiwei1,*， ZHU Yongzhe1

1.Department of Microbiology，The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China; 2.Student 5 Team,Department of Naval Medicine,The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China

Enterovirus 71 (EV71) is a major pathogen of hand,foot and mouth disease which is known as a neglected tropical infectious disease.EV71 is responsible for several outbreaks in the Asia-Pacific Region over the past 15 years.Since the effective control of poliovirus,EV71 has been regarded as the most important neurotropic enterovirus and its severe neurological complications threaten the children’s health.Appropriate animal models of EV71 infection are essential to understand the neuropathology and to facilitate the development of effective vaccines and drugs.In this paper,we review the characteristics,applications and limitations of three major kinds of established animal models,including non-human primate models,mouse-adaptation models and transgenic mouse models.

Enterovirus 71; Animal model; Applications and limitations

第二军医大学创新能力培养计划(FH2015146)

朱勇喆

*同为第一作者

2016-03-30)