小RNA对胞内菌生长、毒力及铁水平的调节作用

吴铮，李文静，李爱梅，付英梅，张凤民

哈尔滨医科大学微生物学教研室，伍连德研究所，黑龙江省免疫与感染重点实验室，黑龙江省普通高校病原生物学重点实验室，哈尔滨150081



·综述·

小RNA对胞内菌生长、毒力及铁水平的调节作用

吴铮，李文静，李爱梅，付英梅，张凤民

哈尔滨医科大学微生物学教研室，伍连德研究所，黑龙江省免疫与感染重点实验室，黑龙江省普通高校病原生物学重点实验室，哈尔滨150081

细菌小RNA(small RNA，sRNA)是一类长度为50～500个碱基，具有调控转录、翻译和mRNA稳定性的非编码调节性RNA。随着越来越多的sRNA被鉴定，部分细菌的sRNA功能已逐步阐明，主要参与调控细菌的基因表达、增殖、毒力及对环境的应激反应等生物学过程。本文就胞内菌(如沙门菌、李斯特菌、嗜肺军团菌等)sRNA对其自身在宿主细胞内的生长、毒力和铁水平的调控作用进行综述。

细菌；小RNA；胞内菌；毒力；生长

细菌小RNA(small RNA，sRNA)是一种非编码、长度为50～500个碱基的调节性RNA，主要通过与细菌其他RNA的碱基互补配对，或与蛋白直接结合，参与调控细菌基因组的转录和翻译过程[1]。随着RNAseq方法的发展和完善，越来越多的sRNA被发现和鉴定，其具体功能逐步得到阐明。

根据细菌sRNA的功能，可分为反式编码sRNA、顺式编码sRNA及与蛋白结合的sRNA三类[2]。其中，反式编码sRNA是指通过与靶基因不完全碱基互补配对而发挥调控作用的sRNA，其只能与靶基因有限互补；反式编码sRNA还可直接结合核糖体结合位点(ribosome-binding site，RBS)而抑制翻译启始[3]。与反式编码sRNA不同，顺式编码sRNA可与靶mRNA完全互补配对，常位于相应基因的非翻译区，可通过重排RNA二级结构来影响mRNA稳定性，也可在翻译水平起调控作用[2-3]。除以上两种以RNA-RNA结合形式进行调控的sRNA外，sRNA还可直接与细菌调节性蛋白相互作用，这种sRNA称为与蛋白结合的sRNA，能影响蛋白活性[4]。

细菌sRNA可通过以上转录后调控方式调控细菌的多个生物过程，包括细菌对营养的摄取及转运[5]、细菌与细菌之间的作用[6]、细菌生物膜的形成[6]，以及细菌对温度或pH改变、饥饿、缺氧等情况的应激反应[7]等。

根据致病菌与宿主细胞的关系，细菌可分为胞外菌和胞内菌。胞外菌是指细菌侵入机体内，寄居在宿主细胞外如细胞外血液、淋巴液等的细菌，常见的有葡萄球菌、大肠埃希菌等；胞内菌是指细菌侵入机体内，直接侵入或被吞噬进入宿主细胞中的细菌，可躲避宿主细胞内吞噬体的活化而存活于细胞质中，同时能借助宿主蛋白和核糖体等进行生长和繁殖[8]。胞内菌可分为兼性胞内菌和专性胞内菌，兼性胞内菌既可在胞内寄居又可在无生命的培养基中生长，如嗜肺军团菌、李斯特菌、伤寒沙门菌、布氏杆菌和结核分枝杆菌等；专性胞内菌则只能在活细胞中生长和繁殖，如衣原体等。本文以胞内菌为对象，综述sRNA对其自身在细胞内的生长、毒力及铁水平的调节作用。

1　sRNA对胞内菌生长的调控作用

细菌sRNA转录受环境因素的影响，可间接引起相关基因的表达变化及一系列后续反应。细菌入侵机体内，可感受到低温、营养缺乏或应激等外部环境的变化，从而改变自身sRNA的表达[9]。

在巨噬细胞内，嗜肺军团菌的一些sRNA(如6S RNA)表达量高于其在正常培养条件下的表达量，同时发现其可正向调节许多基因，如groES和recA等，这些基因参与调节营养物质摄取、应激反应和Icm或Dot影响因子的形成；如果缺少6S RNA，可导致嗜肺军团菌在细胞内生长减少1 000%[10]，从而证明细菌sRNA 6S RNA对宿主内嗜肺军团菌生长起重要调节作用。

在鼠伤寒沙门菌毒力株SL1344感染的成纤维细胞中，发现某些胞内非生长菌中的两种sRNA(RyhB-1和RyhB-2)表达上调，提示这两种sRNA可能抑制鼠伤寒沙门菌在成纤维细胞中的生长；进而用胞内细菌增殖实验证实，尽管sRNA RyhB-1或RyhB-2突变株对细菌入侵成纤维细胞的百分率无显著变化，但sRNA RyhB-1和RyhB-2同时突变的鼠伤寒沙门菌在细胞内生长率显著上升，表明sRNA RyhB-1和RyhB-2可调控鼠伤寒沙门菌在成纤维细胞中的非增殖状态[11]。然而，目前为止sRNA RyhB-1和RyhB-2对鼠伤寒沙门菌在细胞中生长的调控机制研究还不完善，仅发现鼠伤寒沙门菌感染成纤维细胞时sRNA RyhB-1和RyhB-2拮抗调节一种可能与内膜相关的蛋白YeaQ，使其表达降低[11]。

与鼠伤寒沙门菌相似，李斯特菌的部分sRNA也可调控其在宿主细胞中的生长。通过分析李斯特菌RNA表达谱，发现其sRNA(如Rli31、Rli33和Rli50)在细胞内的表达量高于在细胞外生长时的表达量。其中sRNA Rli31位于基因lmo0559上游，而lmo0559编码CorA超家族，参与镁或钴摄取；sRNA Rli33是一个在lmo0671与lmo0672基因之间编码长534个核苷酸的sRNA[12]。此外，在体外特殊培养基BHI中，sRNA Rli31、Rli33、Rli50突变株与野生株的生长并无差异；而在P388D1小鼠巨噬细胞感染模型中，sRNA Rli31、Rli33、Rli50突变株的生长能力明显低于野生株；在小鼠感染模型中，感染后第3天sRNA Rli31、Rli33和Rli50突变株在小鼠肾和肝中的生长能力明显低于野生株[13]。以上研究表明，sRNA可调控李斯特菌在宿主细胞中的生长情况。

专性胞内菌衣原体的Hc1是组蛋白同系物，可通过结合其自身染色体，抑制衣原体基因的转录。当Hc1脱离DNA结合时，衣原体基因组开始转录翻译，同时伴随衣原体的原体(elementary body，EB)向网状体(reticulate body，RB)分化，从而调控衣原体的生长和代谢[14]。衣原体sRNA IhtA的靶基因hctA可编码蛋白Hc1，在衣原体感染细胞0、1、2、4、6、12和24 h检测Hc1蛋白，发现感染6 h之前水平相对不变，6～12 h水平下降，而12～24 h水平上升，RB开始向EB分化；sRNA IhtA在感染4 h首次被检测到，12 h表达量最高，24 h表达量最低[15]。此外，过表达Hc1的大肠埃希菌在培养基中菌落明显少于空载体菌落[15]。以上研究表明，sRNA IhtA可在衣原体感染细胞时抑制细菌的生长和繁殖。

由于sRNA在调控胞内菌生长代谢中起重要作用，而抗菌药物又可特异性地干扰细菌的生长和代谢达到杀菌或抑菌的效果，所以人们推测sRNA可能是寻找抗菌药物的新靶点[16]。这也是研究sRNA对胞内菌调控作用的最终目的。用Nva-FMDP 处理沙门菌时sRNA GlmZ和GlmY的表达量上升，GlmZ和GlmY沙门菌突变株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)较野生株降低400%～6 400%，表明GlmZ和GlmY对沙门菌的药物敏感性有很强的调控作用，为临床上治疗细菌感染提供了理论依据[17]。

2　sRNA对胞内菌毒力的调控作用

最近报道，细菌sRNA可通过调控细菌在宿主细胞中的毒力而使细菌适应感染细胞内的环境变化[18]。如李斯特菌sRNA Rli27调控一种编码与毒力有关的膜蛋白的基因cislmo0412，从而调控细菌毒力[19]。sRNA Rli27还可通过靶向lmo0514基因的5′-UTR(234个核苷酸)而调控细菌细胞壁相关蛋白的表达水平，因为该基因可编码一种功能未知的表面蛋白，并在细胞壁上富集[20]。此外，与体外培养菌株相比，感染细胞中李斯特菌sRNA Rli27的表达量增高20～25倍。但在上皮细胞JEG-3中，与野生株相比，李斯特菌sRNA Rli27缺失突变株的Lmo0514蛋白表达量降低250%～300%[21]。以上结果表明，李斯特菌sRNA Rli27能调控其在感染过程中的毒力。另有研究发现，在细菌包膜压力变大时李斯特菌可诱导sRNA LhrC表达，而李斯特菌sRNA LhrC能抑制细菌lapB基因(编码细菌进入非吞噬细胞所需的黏附素)的翻译，从而降低细菌在感染宿主中的毒力[22]。

在鼠伤寒沙门菌感染成纤维细胞模型中，鼠伤寒沙门菌sRNA IesR-1持续表达，但在细菌生长受到抑制处理时表达上调[23]。鼠伤寒沙门菌sRNA IseR-1可与细菌感染细胞时所必需的在pSLT毒力质粒上编码毒力蛋白的PSLT047基因mRNA 3′-UTR不完全互补结合，从而调控细菌毒力；鼠伤寒沙门菌sRNA IesR-1缺失突变株在人类成纤维细胞中持续感染的能力下降，且在鼠伤寒模型中细菌毒力减弱[23-24]。以上研究表明，鼠伤寒沙门菌sRNA可调控细菌的毒力。

通过RNA杂交预测布氏杆菌sRNA BSR0602的靶基因是gntR。在野生株与sRNA BSR0602突变株、野生株与sRNA BSR0602过表达株的竞争性感染小鼠实验中，分别以相同剂量的两种细菌混合注入小鼠腹腔感染24 h，将感染小鼠肾匀浆分别接种于卡那霉素抗性的TSA培养基(适用于sRNA BSR0602突变株培养)、氨苄西林抗性的TSA培养基(适用于sRNA BSR0602表达株)和TSA培养基，细菌计数发现肾中sRNA BSR0602过表达株菌量/野生株菌量比值为0.3，肾中sRNA BSR0602突变株菌量/野生株菌量比值>1，表明sRNA BSR0602突变株的毒力大于野生株，而sRNA BSR0602过表达株的毒力小于野生株。同时，在野生株与sRNA BSR0602突变株、野生株与sRNA BSR0602过表达株的竞争性感染细胞实验中，分别以相同剂量的两种细菌混合后感染RAW264.7巨噬细胞，发现sRNA BSR0602过表达株存活率明显低于野生株[25]。在布氏杆菌16M及其gntR突变株感染小鼠模型中，不同感染时间点sRNA BSR0602表达水平与gntR表达水平成反比，且小鼠肾中gntR突变株数量明显少于野生株，提示sRNA BSR0602可负调控靶基因gntR的表达，从而降低布氏杆菌在细胞中的存活率[25]。这些均表明布氏杆菌sRNA BSR0602可负调控细菌在宿主内的毒力及其存活率。

3　sRNA对胞内菌铁水平的调控作用

铁是细菌生长必需的重要元素，参与许多生物学过程，包括细菌生长分化、电子转移、氧运输等。细胞内铁的含量增加，会直接导致活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平上升，从而对细菌造成损伤[26]。当细菌受到氧化胁迫时，可通过诱导铁硫蛋白形成来进行自身保护[27]。

在大多数细菌中，铁吸收调节蛋白(ferric uptake regulator，Fur)可调节细菌的铁稳态。在富铁条件下，Fur通常抑制铁载体的生成和铁贮存蛋白基因的表达；在低铁条件下，Fur失活，使摄取铁的相关基因表达，进而造成铁载体生成增加[28]。在肠道沙门菌fur突变株中，sRNA RfrA和RfrB可增加细菌对氧化应激的敏感性，这可能是由于sRNA RfrA和RfrB抑制细菌中参与氧化应激的含铁蛋白生成，从而增加细菌内游离铁的水平。此外，肠道沙门菌sRNA RfrA和RfrB突变株铁载体产量高于野生株，表明sRNA RfrA和RfrB也可通过抑制细菌中铁载体的生成来调控细菌内铁的水平[29]。

鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞时，鼠伤寒沙门菌sRNA RyhB-1和RyhB-2被诱导表达[30]。在高铁和H2O2条件下，体外培养鼠伤寒沙门菌sRNA RyhB-1和RyhB-2突变株与野生株发现，sRNA RyhB-1和RyhB-2突变株中可调控铁稳态且能与Fe2+结合的羰基蛋白含量高于野生株，提示sRNA RyhB-1和RyhB-2下调含铁蛋白(使细菌在缺铁条件下存活)水平[31]。以上均表明鼠伤寒沙门菌sRNA可能参与调控细菌内的铁水平[32]。

布氏杆菌sRNA BsrH位于布氏杆菌基因hemH与编码脂蛋白Omp10的基因之间。在细菌感染非吞噬细胞HeLa和吞噬细胞J774A.1时，sRNA BsrH过表达株与野生株胞内细菌量相似；在小鼠感染模型中，小鼠肾中sRNA BsrH过表达株与野生株胞内细菌量也相似。此外，在低铁条件下体外培养4 h，检测布氏杆菌sRNA BsrH的表达量，发现缺铁时BsrH表达水平下降；同样在低铁条件下，sRNA BsrH过表达株比野生株存活率低，表明布氏杆菌sRNA BsrH不能调控细菌的毒力，但与细菌内铁的代谢平衡有关[33]。

4　结语

本文就胞内菌sRNA对宿主细胞内细菌自身生长、毒力和铁水平的调控作用进行综述，介绍了细菌sRNA在许多生物过程(如环境传感，压力适应，细菌毒性、传染性及新陈代谢)中的重要作用。考虑到病原菌中sRNA可能模仿真核微小RNA(microRNA，miRNA)破坏宿主细胞的功能[32]，且最近有报道大肠埃希菌sRNA OxyS和DsrA可通过调节秀丽隐杆线虫的基因表达从而调控其生理作用[34]，推测sRNA可能在感染过程中发挥调控宿主细胞功能的作用。随着对细菌sRNA的深入分析和逐步认证，其新的调节机制及生物学功能可能得到进一步阐明。

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.ZHANG Fengmin,E-mail: fengminzhang@ems.hrbmu.edu.cn

Regulatory role of small RNA in intracellular bacterial growth,virulence and iron level

WU Zheng,LI Wenjing,LI Aimei,FU Yingmei,ZHANG Fengmin

Department of Microbiology,Harbin Medical University,Wu Lien-Teh Institute,The Heilongjiang Key Laboratory of Immunity and Infection,The Key Laboratory of Pathogenic Biology,Heilongjiang Higher Education Institutions,Harbin 150081,China

Small RNA (sRNA) is a class of non-coding RNA of 50-500 bases with a regulatory function on transcription,translation and mRNA stability.Bacterial sRNAs have been implicated in gene expression,cellular proliferation,virulence and adaptation to environmental conditions.The role of sRNAs in intracellular infection (such asSalmonella,Listeria,Legionellapneumophia,etc.),including the regulation on growth,virulence and host iron levels is reviewed in this paper.

Bacterium; Small RNA; Intracellular bacterium; Virulence; Growth

国家自然科学基金(J1103609、J1210062、31370164、811013000)

张凤民

2016-04-21)