肠道菌群调节免疫反应增强肿瘤治疗效果

宗方方，　谭　俊，　邵　雷，　陈代杰*

1.上海师范大学 生命与环境科学学院，上海 200234； 2.中国医药工业研究总院上海医药工业研究院 创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 201203

肠道菌群调节免疫反应增强肿瘤治疗效果

宗方方1,2，谭俊2，邵雷2，陈代杰2*

1.上海师范大学 生命与环境科学学院，上海 200234； 2.中国医药工业研究总院上海医药工业研究院 创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 201203

摘要：人体健康与肠道菌群息息相关，越来越多的研究显示正常菌群不仅在消化、免疫等方面有诸多不可替代的作用，肠道菌群结构的改变与失衡更是与肥胖、糖尿病、心脑血管疾病、肿瘤等多种疾病密切相关。最新研究表明药物刺激免疫系统引起的抗肿瘤免疫反应以及自身免疫反应都离不开肠道菌群的参与，肠道菌群能够通过调节免疫反应增强肿瘤治疗效果。

关键词：肠道菌群； 人体健康； 免疫反应； 肿瘤治疗

肠道菌群是一个独特多样的生态系统，其种类超过1000种，细胞总数高达1014，是已发现的生态系统中细胞密度较高的系统之一[1]。种类繁多的肠道菌群不仅能实现自身间物质及信息交换，且能与宿主细胞之间不断地进行信息交流、参与宿主代谢、生理性地调控重要化学物质的转化。肠道菌群在宿主体内扮演着非常重要的角色，越来越多的研究证实人体健康与肠道菌群息息相关，不仅在消化、免疫等方面有诸多不可替代的作用，更是与肥胖[2-4]、糖尿病[5-7]、心脑血管疾病[8，9]、艾滋病[10]、癌症[11-13]等多种疾病密切相关。最新的研究表明：肠道菌群能够通过调解肿瘤微环境中抗肿瘤相关免疫反应，从而增强抗癌药物的治疗效果[14-19]。

1肠道菌群增强小分子类药物的肿瘤治疗效果

1.1铂类化合物

铂类药物是迄今为止应用最广泛的抗肿瘤药之一。自1979年第一个铂类药物顺铂问世以来，铂类药物为许多肿瘤的化疗提供了有力的武器。由于顺铂的毒性及耐药性，驱使一系列毒性或耐药性更小的铂类抗肿瘤药在此基础上产生，至今为止已有5种铂类药物成功上市，其中卡铂和奥沙利铂在全球广泛应用，奈达铂、洛铂、庚铂在亚洲部分地区得以上市应用。

Iida等人[14]研究证实肠道菌群可以增强铂类等化疗药物对肿瘤的治疗效果。Iida等人将小鼠的饮水中加入万古霉素、亚胺培南和新霉素组成的抗生素混合物(ABX)，三周后向小鼠皮下注射EL4及MC38肿瘤细胞，当肿瘤直径大于4毫米时采用铂类药物对小鼠进行化疗。研究结果显示奥沙利铂可以根除荷瘤小鼠体内绝大多数皮下肿瘤，从而延长小鼠的存活时间，经过抗生素ABX处理后，明显减慢了小鼠体内肿瘤的衰亡，降低了小鼠的存活率。经过抗生素ABX处理同样也降低了顺铂对EL4肿瘤细胞的治疗效果。GF小鼠(无菌小鼠)实验也证实缺少肠道菌群会降低铂类化合物对肿瘤治疗的效果。Iida等人[14]通过基因表达分析发现，铂类化合物的抗肿瘤作用并不依赖肿瘤坏死因子，而是通过产生活性氧簇(ROS)从而引起DNA损伤及细胞凋亡。在经ABX处理小鼠或GF小鼠中，肠道菌群的缺失引起ROS产生减少及细胞毒性的降低，导致铂类化合物对肿瘤细胞治疗效果减弱。

1.2环磷酰胺

环磷酰胺(CTX)是一种有效的烷基化抗肿瘤药物，是目前临床上重要的抗肿瘤药物之一。它能够诱导免疫原性肿瘤细胞死亡，破坏免疫抑制性T细胞，协助Th1和Th17细胞控制肿瘤细胞增殖。

Viand S等人[15]通过小鼠模型研究发现，环磷酰胺能够激发小肠内某些特定的革兰氏阳性菌迁移，从而引起小肠菌群的显著改变。Sophie Viaud等人通过高通量焦磷酸测序和QPCR分析了肠道菌群的整体组成，发现经过环磷酰胺治疗后的荷瘤小鼠小肠内细菌总数及柔嫩梭菌的数目都没有改变，但会导致约氏乳杆菌、鼠乳杆菌、海氏肠球菌等减少，并向二级淋巴器官发生选择性迁移。同时通过流式细胞仪组织分离和原位免疫荧光染色发现，服用环磷酰胺后引起菌群失调的同时，小肠固有层中CD103+CD11b+树突细胞及αβ(TCRαβ)+CD3+T细胞分泌转录因子RORγ t的能力明显减弱。环磷酰胺治疗后的SPF小鼠(无特定病原体小鼠)脾细胞体外释放IL-17(白介素-17)增加，而在GF小鼠中未能得到此结果。研究显示在使用广谱抗生素(粘菌素、氨苄西林、链霉素等联合用药)处理肠道后，也抑制了脾细胞对IL-17和IFNγ的环磷酰胺刺激性分泌。用万古霉素和革兰氏阳性菌特异性抗生素治疗小鼠同样减少了环磷酰胺诱导型TH17细胞的转化。Sophie Viaud等人进一步研究发现在二级淋巴器官中，这些肠道细菌能够刺激“病原性”辅助T细胞17(pTH17)和TH1记忆细胞产生免疫反应，而荷瘤无菌小鼠或经抗生素作用杀死革兰氏阳性菌的荷瘤小鼠的pTH17细胞特异性免疫反应明显减弱，且肿瘤细胞对环磷酰胺表现出耐受。然而，通过pTH17细胞转移之后又部分恢复了无菌小鼠及抗生素处理小鼠体内环磷酰胺的抗肿瘤作用[16]。这些结果表明肠道微生物能够调节环磷酰胺引发的宿主免疫反应，从而增强环磷酰胺抗肿瘤治疗效果。

1.3CpG寡核苷酸

免疫系统通过高度保守的受体识别病原体，从而激活机体的固有免疫以及获得性免疫应答。Toll样受体(TLR)是目前研究最清楚的受体之一，共有10个分子家族。CpG寡核苷酸(CpG-ODN)是TLR9受体激动剂，能够直接诱导浆细胞样树突状细胞(pDC)的活化和成熟，促进Th1型细胞因子的分泌及抗原提呈细胞(APC)的成熟和活化，具有激活机体免疫系统的作用。

Iida等人[14]向荷瘤小鼠体内连续三周给药ABX，当肿瘤直径大于4毫米时对小鼠进行CpG-ODN免疫治疗。肿瘤基因表达分析结果显示经抗生素处理，小鼠体内与炎症反应、吞噬作用、抗原提呈及适应性免疫反应有关的基因下调，而与组织发育、恶性肿瘤和新陈代谢相关的基因上调。抗生素作用显著破坏了小鼠肿瘤细胞中CpG-ODN诱导型Tnf的表达及白细胞产生的频率，同时降低了某些免疫细胞中细胞因子的数量及肿瘤相关树突细胞中CD86的表达及IL-12B的产生。为了确定ABX的作用效果是否与减少细菌负荷量有关，Iida等人随后采用GF荷瘤小鼠及SPF荷瘤小鼠分别接受CpG-ODN治疗。结果表明GF小鼠对CpG-ODN的治疗反应明显减弱，肿瘤坏死因子(TNF)和IL-12B的产生量显著降低。进一步研究发现灌胃给药细菌脂多糖(LPS)可以很大程度上修复ABX处理后野生型小鼠肿瘤细胞中的Tnf的表达及白细胞产生的频率，但是在Tlr4缺失型小鼠中未产生这种效果，Tlr4缺失反而会导致免疫治疗后Tnf感应减弱及肿瘤细胞退化降低[14]。这些研究结果表明，细菌产物(如LPS)经过TLR4活化后直接或间接诱导肿瘤相关骨髓细胞对CpG-ODN的免疫应答，肠道菌群数量的减少影响CpG-ODN抗肿瘤免疫反应的发生，导致CpG-ODN肿瘤治疗效果减弱。

2肠道菌群增强检测点抑制剂及抗体类药物的肿瘤治疗效果

2.1CTLA-4检测点抑制剂

CTLA-4(即细胞毒性T细胞相关蛋白-4)是一种T淋巴细胞负调节器，影响人体的免疫系统，削弱其杀死癌细胞的能力，是目前研究最热的癌症免疫治疗靶点[16]。美国FDA于2011年批准免疫检查点抑制剂Ipilimumab上市，用于治疗晚期黑色素瘤。Ipilimumab能与CTLA-4结合并有效阻滞CTLA-4与其配体CD80/CD86的相互作用，增加T细胞的活化和增殖。然而一些临床结果表明仅有20%的黑色素瘤患者经过Ipilimumab治疗后获得了寿命的延长。

Zitvogel[17]认为Ipilimumab能够引发溃疡并引起肠道内一部分细菌的死亡，这一副作用暗示Ipilimumab的药效可能与肠道微生物有很大关系，肠道内某一特定类型的细菌可能参与了微生物的抗肿瘤效应。为了验证这一猜想，Zitvogel等人[17]通过小鼠黑色素瘤模型及MC38肿瘤模型研究发现抗CTLA-4抗体药物能够抑制SPF小鼠中肿瘤细胞的生长，而在GF小鼠中未表现这种作用。向小鼠给药广谱抗生素混合物(ACS，即氨苄西林、粘菌素、链霉素联合用药)及亚胺培南单独用药也会造成抗CTLA-4抗体药物治疗效果减弱。这些结果表明Ipilimumab等抗CTLA-4抗体药物发挥抗癌作用需要肠道菌群的帮助。采用16S rRNA高通量基因测序分析发现，抗CTLA-4抗体药物能够引起肠道菌群的明显改变，CTLA-4封锁导致小鼠粪便中拟杆菌属和伯克氏菌属数量减少。采用QPCR对小肠粘膜及粪便中拟杆菌属进行分析显示接受抗CTLA-4抗体药物后拟杆菌属相对丰度呈减少趋势，而小肠粘膜中某些特殊种属，如多形拟杆菌及单行拟杆菌相对丰度提高。随后Zitvogel等人将特定的微生物种群如多形拟杆菌、脆弱拟杆菌等定植到经ACS处理小鼠及GF小鼠肠道内部，结果显示肠道菌群的再生能够恢复抗CTLA-4抗体药物的抗肿瘤效果。同样，通过向抗CTLA-4抗体药物治疗的GF小鼠口服喂食脆弱拟杆菌可以提高其淋巴肿瘤细胞中Th1免疫应答，促进树突细胞的成熟及分化。这些研究结果表明拟杆菌属在调节CTLA-4检测点抑制剂抗肿瘤免疫刺激中起到关键作用。

2.2抗PD-1/PD-L1抗体类药物

肿瘤逃逸是目前肿瘤免疫治疗公认的障碍，已有研究表明程序性死亡配体-1(PD-L1)与肿瘤的免疫逃逸机制有关。癌细胞能够在自身表面产生PD-L1，与T细胞表面的细胞膜蛋白受体PD-1结合，PD-1/ PD-L1信号通路的激活可导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，使肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤，从而促进肿瘤的发生与生长[18]。因此，采用抗PD-1/PD-L1抗体类药物阻断PD-1/PD-L1信号通路可以逆转肿瘤免疫微环境，增强内源性抗肿瘤免疫效应。

Sivan A等人[19]最新研究表明抗PD-L1抗体抗肿瘤作用存在个体差异可能与个体之间的肠道微生物组成存在差异密切相关。 Sivan A等人选用了分别来自Jackson实验室(JAX)和Taconic农场(TAC)的携有不同共生微生物群的同一品系小鼠，比较它们皮下黑色素瘤的增长。研究发现JAX小鼠体内黑色素瘤的生长速度明显慢于TAC小鼠，而经过共同饲养后消除了两种小鼠在肿瘤生长和免疫应答反应之间的差异，由此表明肠道微生物菌群差异能影响小鼠抗肿瘤免疫反应。且JAX小鼠体内自身特异性T细胞应答反应和瘤内CD8+T细胞积累明显高于TAC小鼠，表明两种小鼠抗肿瘤免疫反应之间的差异是由免疫系统介导的[19]。为了确定与增强抗肿瘤免疫反应有关的特定细菌，Sivan A等人考察了随着时间的推移小鼠粪便中细菌含量，比较分析TAC小鼠和JAX小鼠257种菌群的相对丰度，双歧杆菌是与肿瘤微环境中活性特异性抗原T细胞积累有明显关联的唯一关键菌群，经鉴定此类双歧杆菌中主要是短双歧杆菌、长双歧杆菌和青春双歧杆菌，且要达到抗肿瘤效果需要活细菌，因此事先服用热失活的双歧杆菌并不会增强肿瘤的治疗效果。Sivan A等人[19]研究表明植入特定菌群与用抗PD-1/PD-L1抗体治疗小鼠均可减缓肿瘤的生长，特定菌群与抗PD-1/PD-L1抗体联合作用显著增强了肿瘤治疗效果。通过大规模测试发现双歧杆菌能够通过与漫游的树突状细胞相互作用触发免疫反应，激活肿瘤杀伤性T细胞。这些研究表明抗PD-1/PD-L1抗体抗肿瘤作用存在个体差异，可能与个体之间的肠道微生物组成存在差异密切相关，双歧杆菌能够促进抗肿瘤免疫反应，增强抗PD-1/PD-L1抗体抗肿瘤作用。

3展望

人类肠道是一个巨大而又复杂的生态系统，在人类的生存中具有十分重要的作用。很早以前，人们就已经意识到了肠道内与人体共生的微生物对于人体健康具有极大的影响力。近年来肠道微生物与免疫系统之间的联系引起了越来越多研究人员的密切关注,且越来越多的研究表明肠道菌群与抗肿瘤免疫反应息息相关。利用肠道微生物与免疫系统之间的联系，通过选择性调节肠道细菌来改善免疫疗法将成为肿瘤治疗的一条新途径。

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Intestinal flora enhance tumor therapeutic effects by modulating immune responses

ZONG Fang-fang1,2, TAN Jun2, SHAO Lei2, CHEN Dai-jie2

1. College of Life and Environment Science, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 2. State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China

AbstractHuman health is related to intestinal flora closely, more and more studies showed that the normal flora played an important role in terms of digestion, immunity, obesity, diabetes, cardiovascular disease, cancer and many other diseases. Recent studies showed that chemotherapy drugs stimulated antitumor immune responses and autoimmune responses required the participation of intestinal flora. The intestinal microbiota could affect the therapeutic effects by modulating the immune responses effects.

Key wordsintestinal microbiota; human health; immune responses; oncotherapy

基金项目：国家“重大新药创制”科技重大专项(No.2013ZX09301302，No.2014ZX09507009-025)国家自然科学基金(No. 81573329)。

作者简介：宗方方(1991～)，女，在读硕士研究生。E-mail：elvazong@163.com。 *通讯作者：陈代杰，男，研究员。E-mail：hccb001@163.com。