实时荧光定量PCR技术在环境领域研究探讨

周震宇，颜智勇

(1 湖南农业大学资源环境学院，湖南　长沙　410128；2 湘潭市环境保护科学研究院，湖南　湘潭　411104)



实时荧光定量PCR技术在环境领域研究探讨

周震宇1,2，颜智勇1

(1 湖南农业大学资源环境学院，湖南长沙410128；2 湘潭市环境保护科学研究院，湖南湘潭411104)

实时荧光定量PCR技术实现了核酸的定量，具有灵敏性高，特异性强的特点。本文从实时荧光定量PCR技术的原理，实时荧光定量PCR技术的优点与缺陷，以及荧光定量PCR技术在国内外环境领域的应用情况对荧光定量PCR技术进行探讨，以期使荧光定量PCR技术在环境领域有着更合适的应用。

实时荧光定量PCR技术；优点与缺陷；应用情况；研究探讨

实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time fluorescent quantitative PCR，Real-time PCR)技术是由美国应用生物系统(Applied Biosystems)公司在1996年推出的。该技术的推出实现了PCR以往只能定性分析而无法定量分析的瓶颈，与常规PCR相比，实时荧光定量PCR技术具有自动化程度更高、特异性更强、能够快速有效解决PCR易污染问题等特点，使得其已在生物技术、医药技术、环境技术等领域得到广泛应用。

1　实时荧光定量PCR技术的原理

在实时荧光定量PCR技术中，它是基于荧光共振能量转移的基础而形成的。荧光共振能量转移的原理是，当一个荧光分子(即分子供体)的荧光光谱的另一分子(即分子受体)和供体荧光团的激发光谱重叠的荧光强度相同的荧光分子是与荧光强度的衰变分子会增加[1]。Ct值表示周期为每个管的荧光信号达到限制值的数目所经历的循环数。实时荧光定量PCR中的Ct值是一个非常重要的因素，C代表循环(Cycle)，t代表阈值(Threshold)。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小[1]。通过使用已知的初始拷贝数的标准品可做出标准曲线，所以，依据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量存在对应关系，因此只需对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值，获得的荧光信号的值可以从项目的拷贝样品数的标准曲线来计算。

相比于常规PCR，实时荧光定量PCR用于改变在荧光信号的实时监测PCR反应的扩增产物的过程中循环，模板的初始量可以定量分析。简言之，实时荧光定量PCR技术的基本原理增加样品核酸由相同的系统和反应条件的指数扩增，正比于产品的对数扩增样品的DNA含量，因为该系统的用于着色或传播的响应结合的荧光标记(荧光探针)的荧光的光产率正比于所用的核酸样品的量进行检测的扩增产物的量就可以通过荧光的量来确定[1]。

2　实时荧光定量PCR技术的优势与缺陷

2.1实时荧光定量PCR技术的优势

与传统的PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术有了更多的改进之处，具体如下[2]：

(1)实时荧光定量PCR实现了核酸的定量化研究，极大的扩展了PCR技术在各个领域的应用；

(2)实时荧光定量PCR技术的核酸对于检测目标核酸具有很高的灵敏度：科尔布(Kolb)等[3]使用实时荧光定量PCR技术来检测环境中的甲烷氧化细菌(Methane oxidizing bacteria)的数量，检测极限能够实现10 cells/样品[4]；

(3)实时荧光定量PCR技术可以在一个大范围内的检测目标核酸数量，简便快捷：对靶DNA的实时荧光定量PCR的标准曲线，通常可以超过7个数量级以上；

(4)实时荧光定量PCR技术安全性高：在样品的定量检测在PCR反应完成后，没有进一步的后续处理，减少了工作量，以除去使用的溴化乙锭(ethidium bromide，EB)等诱变风险的过程。

2.2实时荧光定量PCR技术的缺陷

实时荧光定量PCR技术是一种高效，灵敏，安全的分子生物学手段，已经成为主流定量核酸的技术之一，但此技术还不是很成熟，在使用过程中还存在一些缺陷，具体如下[1-3]：

(1)核酸荧光标记是无法客观地区分目标核酸和非目标核酸的，这会对实验结果的准确性有一定的影响；

(2)标准曲线制作过程是非常复杂的，目前还没有统一的标准方法，这将在一定程度上使得研究人员对各种调查结果缺乏可比性；

(3)许多一定数量的核酸在体内的拷贝数不明确，目前的大多数研究是基于平均份数进行评估，其精度是可疑的；

(4)设计荧光探针和分子信标是十分复杂的技术，目前在我国还没有广泛的应用基础；

(5)实时荧光定量PCR技术所需的基本实验条件和实验费用都相比普通PCR有着较高的要求[3]。

2.3实时荧光定量PCR技术的应用

实时荧光定量PCR技术已经被广泛应用于医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究的各个领域。大量的资料显示，荧光定量PCR技术已经被广泛应用于环境领域。Tay[4]利用特异性16S rDNA引物扩增自养黄色杆菌(Xanthobacterautotrophicus)和分枝杆菌(Mycobacterium)两种甲苯降解菌来检测环境微生物在河流随季节的变化情况。Grüntzig V[5]通过对反硝化亚硝酸盐还原酶基因(nirS)的定量来研究施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)种类的丰度，说明了该种微生物不是海底的主要反硝化微生物。Vaitomaa J[6]利用实时荧光定量PCR技术对湖泊中微囊菌和项圈藻微囊藻素合成酶E拷贝数进行定量，表明湖泊中主要的微囊藻素是微囊菌产生的。Cummings[7]利用荧光定量PCR技术对沿湖泊重金属污染浓度梯度中的还原铁离子泥土杆菌(Geobacteraceae)家族的丰度进行了定量，发现分布相对均匀，泥土杆菌家族的分布基本与重金属离子浓度的影响无关。Hall S J[8]通过采用荧光定量PCR技术对污水处理厂的活性污泥中的Nitrospiraspp进行了监测和定量分析。Harms G[9]通过荧光定量PCR对城市污水处理厂MLSS中的硝化螺菌(Nitrospira)和氨氧化细菌(Ammoniaoxidizingbacteria，AOB)的总量进行了定量监测。

在国内荧光定量PCR技术在环境领域的应用也是越来越广泛。李光伟等[10]通过实时荧光定量PCR对五氯苯酚(Pentachlorophenol，PCP)好氧颗粒污泥中氨氧化细菌的定量分析进行监测，研究表明五氯苯酚对氨氧化细菌的数量影响不大，并且氨氧化细菌的数量与氨氮的去除率无直接关系。李磊等[11]通过实时荧光定量PCR对A2/O短程硝化反硝化系统内的氨氧化菌进行了定量分析，结果表明随着亚硝酸盐积累率的上升，系统内氨氧化细菌的数量也在大幅度上升并且亚硝酸盐积累率的下降相对于AOB菌群数量的下降有一定的滞后性。谢润欣等[12]对城市污水中病原性大肠埃希氏菌毒力基因eaeA和rfbE进行实时荧光定量PCR检测，表明污水二级处理对这两种毒力基因的去除效果明显。李晓岩等[13]利用荧光定量PCR检测腺病毒气在大气中的相对基因拷贝数，表明重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器的第五级，腺病毒气溶胶与粒子相比较大。何恩奇等[14]利用荧光定量PCR方法对产毒微囊藻mcyA基因进行了定量的分析，实现了产毒微囊藻的快速定量监测分析。

3　结　语

实时荧光定量PCR技术自产生至今已在环境领域有了广泛应用，具有灵敏度高、检测范围宽、操作安全等优势，也有不能统一标准曲线、分子信标设计十分复杂等缺陷[15]，但是随着科学技术的进一步发展和完善，荧光定量PCR技术的优势会更加明显，其缺陷也必将会得到解决，荧光定量PCR技术也会有更大的完善，更广泛的应用。

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[15]陈峻峰.抗生素对养猪废水厌氧生物处理系统中微生物多样性的影响[D].长沙:湖南农业大学, 2014.

Study on Real Time Fluorescent Quantitative PCR Technology on Environmental Area

ZHOUZhen-yu1,2，YANZhi-yong1

(1 College of Resource and Environment, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128;2 Xiangtan Municipal Research Institute of Environmental Protection, Hunan Xiangtan 411104, China)

Real-time fluorescent quantitative PCR developed in the base of PCR technique as one kind of quantitative techniques about nucleic acid with high sensitivity and strong specificity. The principle of real-time fluorescence quantitative PCR technology, advantages and disadvantages of real-time fluorescence quantitative PCR technology, application and fluorescence quantitative PCR technology at home and abroad on the fluorescent quantitative PCR technology were studied in order to make the fluorescent quantitative PCR technology be applied more appropriate.

real-time fluorescent quantitative PCR; advantages and disadvantages; application; study research

周震宇(1982-)，男，工程师，从事环境影响评价、环境工程治理、环境监理工作。

颜智勇。

O657

A

1001-9677(2016)012-0153-02