蛇足石杉及石杉碱甲的研究进展

查 冲, 杜亚填,2, 刘 姣

(1.吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室， 湖南 张家界 427000;2.湖南省植物功能成分利用协同创新中心， 湖南 张家界 427000)

蛇足石杉及石杉碱甲的研究进展

查 冲1, 杜亚填1,2, 刘 姣1

(1.吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室， 湖南 张家界 427000;2.湖南省植物功能成分利用协同创新中心， 湖南 张家界 427000)

对蛇足石杉资源及其中的药用活性成分石杉碱甲的相关研究进展进行了综述，指出蛇足石杉及石杉碱甲高含量天然植物资源的大规模、高效再生增殖，是目前解决石杉碱甲生产原材料来源最有效、最快捷的有效途径。

蛇足石杉； 石杉碱甲； 内生菌； 合成

蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.)Trev.)，又名千层塔，为石杉科(Huperiaceae)、石杉属(HuperziaBernh.)、石杉组(Sect serrate ea (Rothm.)Holub)多年生生蕨类植物。全草可供药用，民间用于治疗肌肉痉挛、瘀血肿痛、跌打损伤、神经性头痛、坐骨神经痛、胆结石引起的剧痛。同属种下有2个变型即长柄蛇足石杉(H.serrataf.longipetiolata)和小叶蛇足石杉(H.serrata)。来源于蛇足石杉的石杉碱甲是一种高效乙酰胆碱酯酶抑制剂，对老年性痴呆的治疗非常有效。因而蛇足石杉与石杉碱甲均受到国内外的广泛关注，1972年国内首次报道蛇足石杉中的生物碱石杉碱甲(Huperzine A，Hup A)在动物试验上有横纹肌松弛作用，之后证明具有抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)活性，是一种低毒、高效、可逆和高选择性的Ach E抑制剂，并进一步发现其具有提高记忆效率的功能，可用于治疗老年性痴呆症、小儿麻痹症和重症肌无力，在提高青春期学生记忆力和学习成绩等方面有显著功效[1]。但蛇足石杉是一种小型蕨类植物，植株矮小、生长极为缓慢、生物量小，自然状态下通过孢子繁殖，自然繁殖能力差，多分布在空气湿度较高的中高海拔山林下，可供利用的野生资源极其有限，到目前为止，还没有关于其人工繁殖、栽培获得成功的报道。本文对蛇足石杉资源及其中的药用活性成分石杉碱甲的研究进展进行了综述。

1 蛇足石杉

1.1生物学特性

王德立[2-3]等通过研究发现蛇足石杉成株株龄为芽托层数+3，且其主要分布于长江以南各省，东北地区有零星分布。周毅[4]等发现蛇足石杉形态解剖学上的差异性或可塑性是其赖以适应环境和生存的基础。鲁润龙[5]等首次较系统地研究了蛇足石杉的生物学特性，包括其内部结构、外部形态、菌根、生活史、孢子囊和孢子形态、生长特性、生态学、地理分布和群落学特性等。发现其菌根为不定根，生于茎的基部，共生菌为真菌，共生真菌的菌丝只侵入根的皮层细胞间隙, 不侵入细胞内, 为外生菌根。营孢子繁殖，生活史包括孢子萌发、配子体形成等阶段，即孢子萌发形成配子体，由配子体再产生精子和卵，在有水的环境下，精子游向卵使其受精，受精卵发育成胚, 幼胚暂时寄生在配子体上，长大后配子体死亡, 孢子体即行独立生活，幼孢子体的顶端先长出一片幼叶, 随着幼苗的长大, 相继长出新叶, 等到幼苗长到2～3 cm 时, 就出现二叉分枝。其植株小型, 为丛生的草本植物, 土生或生于苔藓层中，通过三种方式成苗, 一是孢子繁殖成新苗；二是芽胞繁殖成新苗；三是分株繁殖成新苗。黄骥[6]等则发现决定蛇足石杉分布和居群扩大的关键因素是特化的生态位。但其繁殖、孢子萌发等除与必要的湿度条件相关外，是否还与其他如土壤微生物条件有关还有待进一步研究，特别是石杉碱甲的生物合成对蛇足石杉的生物学意义更需要研究探讨。

1.2生态学特性

蛇足石杉群落多生于海拔400～1600 m中低山阴湿的山顶岩石上、山地针阔叶混交密林下或沟谷阴湿地。全国均有分布，且广范分布于亚洲其他地区，大洋洲，以及中美洲的墨西哥、古巴等地也有分布。多丛生，直立，叶披针型，边缘具锯齿，叶缘是否呈波状是区别该属种类的主要形态特征，且具有2个种下变型，即长柄蛇足石杉和小叶蛇足石杉。群落上层乔木树种主要有毛竹(Phyllostachysheterocycla)、三尖杉(Cephalotaxusfortunei)等，灌木树种有红檵木(Loropetalumchinense)、金银花(Lonicerajaponica)、映山红(Rhododendronmariesii)、紫金牛(Maesajaponica)、格药柃(Euryamuricata)等, 草本植物有蕨、多花黄精(Polygonatumcyrtonema)、三脉紫菀(Asterageratoides)、泽兰(Eupatoriumjaponicum)及浙皖粗筒苣苔(Briggsiachienii)等，蛇足石杉伴生植物有金发藓(Polytrichumcommune)及暖地大叶藓(Rhodobryumgiganteum)等藓类[5]。李沛玲[7]等在研究蛇足石杉优质高产栽培过程中发现，磐安产种群的环境特点是电导率以及pH值相对较低，郁闭度高，年均降水量，空气相对湿度偏大，对Ca、Mg等元素利用率较高，且土壤中Al的含量较高等。吴荭等[8]通过调查研究进一步阐述了中国蛇足石杉的变异类型和分布区域，主要有长柄蛇足石杉和小叶蛇足石杉等类型，主要分布在亚洲，大洋洲，美洲热带亚热带及温带地区，尤其在东亚的中国东部和东南部形成了该种种下变异和多度中心等区域。这些研究虽报道了蛇足石杉生境特性及其分布基本规律，但影响其分布与生长的关键生态因子仍需进行更加深入的研究，以为蛇足石杉人工大规模繁殖栽培提供基础。

1.3蛇足石杉的人工栽培及人工繁殖

石杉碱甲的药理作用被发现之后，野生蛇足石杉立即遭到过度采挖，导致资源迅速濒临枯竭。因此，如何解决蛇足石杉的资源危机问题，便成了国内外研究的热点。石松科植物的繁殖培养主要包括组织培养、孢子繁殖、扦插繁殖等[9]。龙华[10]等利用蛇足石杉带茎尖插条和芽胞进行野外半人工辅助繁殖时发现，蛇足石杉孢子萌发困难、配子体受精存在障碍。但相关研究报道较少，且不够深入。所以，有关蛇足石杉配子体形成和受精的生物学机制等还有待进一步研究。

1.4蛇足石杉组织细胞培养

蛇足石杉分布零散，资源更新周期较长，可供采取的天然资源非常有限，直接采收天然资源不可行[8]。必须通过人工繁育手段解决蛇足石杉资源匮乏问题，组织细胞培养被认为是解决蛇足石杉资源可持续开发利用问题最为有效的途径之一。周颖[11]等对蛇足石杉的组织培养进行了初步探讨，在培养过程中遇到了初代培养污染问题，如愈伤组织污染、茎尖灭菌难等问题，通过研究发现，采用0.1%升汞液多次消毒，无菌水冲洗5次，使灭菌难问题得到了初步解决。杨雪飞[12]等也取得了较好的灭菌效果，可获得52%无菌外植体，为蛇足石杉体胚或愈伤发生提供了诱导可能。马华升[13]等进行蛇足石杉组织培养工程研究时选用孢子囊作为外植体，但遇到了孢子萌发难的问题，且很难诱导出愈伤组织。孙玉强[14]等经过初培养和3至4轮继代培养，从未污染的蛇足石杉茎尖中，获得了约5%的愈伤组织。沈晓霞[15]等在茎尖组织培养过程中，也诱导出了愈伤组织。但这些研究均没有建立起蛇足石杉组织培养快繁体系。李晓君[16]等研究蛇足石杉茎尖组织培养时发现，蛇足石杉茎尖在无生长调节剂的MS基本培养基上可以通过两种途径再生植株：一是由茎尖直接诱导发生丛生芽，再诱导丛生芽生根再生植株；二是先诱导茎尖发生形成绿色小体(green globular body，GGB)，再诱导GGB产生丛生芽，最后诱导丛生芽生根再生植株，初步建立了蛇足石杉的组织快繁体系。但相关研究成果能否进行大规模生产应用，还未见有相关报道。

1.5蛇足石杉内生菌

龚玉霞[17]等发现在蛇足石杉不同部位中可分离到的内生真菌菌株数不同。其中数目最多的是茎部，有100株。其次是叶部，有73株。根部只有7株。经初步鉴定，这180株菌分属于13属，即交链孢属(Alternaria)、球座菌属(Guignardia)、青霉属(Penicillium)、头孢霉属(Cephalosporium)、间座壳属(Diaporthe)、茎点霉属(Phoma)、镰刀菌属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、组丝核菌属(Phacodium)、轮枝孢属(Verticilliun)、木霉属(Trichoderma)、瓶梗青霉属(Paecilomyces)、刺盘孢属(Colletotrichum)。张琳[18]等从蛇足石杉植物体中分离出7种内生菌，除了上面提到的，还有半知菌亚门丛梗孢目暗梗孢科砖隔孢亚科的镶孢霉属(异孢迭球孢霉)，真子囊菌亚门盘菌目盘菌科的盘霉属，真子囊菌亚门多腔菌目沙卡氏菌科的沙卡氏属。俞超[19]等从蛇足石杉茎中分离出4株内生真菌菌株，分别属于头孢霉属、束梗孢霉属、酵母属和顶孢霉属，从叶中分离出2株内生真菌菌株，分别属于头孢霉属和青霉属。李娜[20]等则证明了蛇足石杉孢子体世代体内也有真菌存在。鞠錾[21]等首次从柳杉叶马尾杉(Phlegmariuruscryptomerianus(Maxim.) Ching ex L.B. Zhang et H.S.Kung)中分离出能产生石杉碱甲的内生真菌，其分属不同种类的芽胞菌属(BlastomycesCost. exRoll.)和葡萄孢属(BotrytisPers. ex Fr.)。从以上可以看出，蛇足石杉内生真菌具有多样性。黎万奎[22]等进行了蛇足石杉内生真菌2F09P03B 产石杉碱甲单株发酵条件的研究，石杉碱甲产量为8.32 μg/L。汪涯[23-24]等发现黄曲霉(Aspergillus flavusLF40)菌株里石杉碱甲含量高达80.1 μg/g (dcw)，并具有体外乙酰胆碱酯酶抑制活性，而且还发现15个属的39株内生真菌显示出乙酰胆碱酯酶抑制活性，且11株有显著的抑制活性，其中7株来源于叶中。承曦[25]等发现蛇足石杉内生真菌xg,g8,g5发酵醇提物能够较为显著地抑制乙酰胆碱酯酶。根据上述学者的研究，蛇足石杉内生真菌在植物体内的种类丰富度分布为茎>叶>根，种类具有生物多样性，且多数内生真菌具有乙酰胆碱酶抑制活性，少数菌株石杉碱甲的含量与蛇足石杉植物含量很接近。但是，可能因为内生真菌长期生活在宿主植物体，与宿主植物形成了互利共生关系，一旦脱离植物体提供的稳定环境，其生物学特性、代谢特性等的稳定性可能会受到影响，导致内生真菌菌株在连续继代后易出现菌种退化现象，影响石杉碱甲的积累[22]。且有关内生真菌产石杉碱甲的机理尚不清楚[23]，故还未见有利用内生真菌纯发酵来工业化生产石杉碱甲的成功报道。

1.6蛇足石杉的分子生物学

随着蛇足石杉活性成分药理学研究的深入开展，该植物的药用价值日益凸显。因此，利用分子生物学、生物信息学、生物化学等的研究手段和技术进行蛇足石杉活性成分生物合成机制研究具有重要的科学意义[26]。姬生国[27]等首次利用叶绿体matK基因序列对10种石杉属植物分子系统关系及分子鉴定进行了研究，发现小杉兰组和蛇足石杉组植物分别聚成一枝，构成姊妹群，其靴带支持率分别为98%和99%。长柄石杉与蛇足石杉分别聚在2个不同进化枝，二者间有19个碱基差异,遗传距离为1.21%，建议应将长柄石杉单独列为一个种。罗红梅[26]等在国内外首次获得蛇足石杉 HsCAS1 基因的编码区序列，为进一步研究 HsCAS1 在石杉科植物甾醇合成途径中的功能及鉴定酶活性位点奠定了基础。黄骥[28]等采用AFLP分子标记对武陵山区蛇足石杉4个居群进行遗传多样性的研究，认为遗传多样性与遗传结构主要决定于居群历史，较少干扰而稳定的居群偏向克隆生殖，遗传多样性较低，而新建居群的遗传多样性则较高，克隆生长、生态位选择、异交，以及有效的孢子风媒传播等可能是其维持较高遗传多样性水平的因素，而过度采挖等人类活动和生境片断化是导致蛇足石杉濒危的主要因素。国外，孙杰因[29]等首次报道了从原先石松属植物中的一个CAO酶(酮氨氧化酶)的克隆和表征。相关基础研究均取得了较大进展，但石杉碱甲生物合成的分子生物学机制尚处在研究之中，石杉碱甲生物合成异源表达、相关工程菌的构建及蛇足石杉分子生物学育种、基因调控等均还依赖相关分子生物学基础研究的未来进展。

2 产石杉碱甲的其他植物

已有研究发现，除蛇足石杉外，还有多种近缘植物如伏贴石杉(H.appressa(Desv.)Löve et D.Löve)、亮叶石杉(H.lucida(Michx.) Trev)、皱边石杉(H.crispata(Ching exH. S. Kung) Ching)、四川石杉(H.sutchueniana(Herter) Ching)、金丝条马尾杉(Phlegmariurusfargesii(Herter) Ching)、闽浙马尾杉(P.minchegensisChing)、柳杉叶马尾杉(P.cryptomerianus(M axim. )Ching comb. Nov)、华南马尾杉(Phlegmariurusfordii(Baker)Ching)、藤石松(Lycopodiastrumcasuauinoides(Spring)Holub)、小接筋草(Lycopodiumselago L)等也产石杉碱甲。邵浩[30]等对比了蛇足石杉、皱边石杉、亮叶石杉以及柳杉叶马尾杉的石杉碱甲含量，发现柳杉叶马尾杉中石杉碱甲含量较高，达1981.27 μg/g。王俊[31]等对蛇足石杉、皱边石杉、四川石杉、金丝条马尾杉、闽浙马尾杉、柳杉叶马尾杉6种石杉植物中石杉碱甲的含量也进行了分析比较，发现也是柳杉叶马尾杉植物中含量最高，可达1.96‰，与邵浩等的研究结果基本一致，而闽浙马尾杉含量最低，只有十万分之6.1。但柳杉叶马尾杉是否可作为蛇足石杉的替代资源，其相对蛇足石杉是否存在资源优势等，均未见有相关的进一步研究报道。

3 石杉碱甲

3.1提取制备

张馨[32]等以10倍量pH=1的硫酸浸提12 h，超声30 min，酸化2次，再用NaOH碱化调pH=9，经硅胶柱色谱法分离出石杉碱甲。查圣华[33]等采用微波辅助提取法，与传统的回流提取工艺相比，大大的缩短了提取时间，并且提高了回收率。沈生荣[34]等用变换pH值法去除杂质，用重结晶法实现了石杉碱甲产品的纯化。刘建廷[35]等采用1∶10料液比浸泡10 h，酸解3次，每次45 min，酸解pH为3.0，酸解温度为55 ℃，碱化pH为9.0，纯化过程中用相当于石杉碱甲溶液体积15%的活性炭在pH为3.0条件下除杂，最后用甲醇重结晶得到了90%以上纯度的石杉碱甲。张洪超[36]等则研究开发了快且成本低的提取纯化方法，即采用制备高效液相色谱仪和三氟乙酸试剂从蛇足石杉中分离和纯化Hup A和Hup B，其中Hup A纯化率可达99.1%。

3.2合成

A.P.Kozikowski课题组(1989年)实现了首例外消旋Hup A的全合成，Kozikowski(2001年)等[37]成功地通过羰基α — 位芳基化构建了石杉碱甲桥环骨架，但此种桥环合成的途径仅在专利中描述，未见公开文献报道，因而反应的真实性有待实践检验。Yang小组(2002年)[38]报道了一种构建石杉碱甲桥环骨架的新途径，但该反应的区域选择性并不理想。Caprio小组(2006年)[39]报道了另外一种通过自由基环合构建石杉碱甲桥环骨架的方法，但该反应生成较多的副产物使该方法的实用性大大降低。随后，Caprio小组[40]在另外一条合成途径中优化了这个方法，但产率仍然很低。Fukuyama小组(2009年)[41]报道了一种新的手性合成石杉碱甲的途径，其关键步骤为酸诱导的烯烃离子化成环反应构建三碳桥环。孙炳峰和林国强小组(2012年)[42]报道了一条高效的全合成路线，其中一个关键反应也是通过Heck反应构建三环骨架，此路线共10步合成步骤，总收率达到 17%，相对以往路线，有了很大改进。美国 White小组(2013年)[43]报道了一条新颖的合成路线，其特色在于两次用到环丁烷裂解反应，但在大量制备时没有优势[44]。但合成产物的医学评价及其工业化生产应用方面均未见相关的进一步报道。

4 具有相同或类似活性的化合物

何煦昌[45-49]等人设计合成了有乙酰胆碱酯酶抑制活性的光学活性石杉碱甲类似物：(-) — 1 — 甲基石杉碱甲，H(±) — 失二碳石杉碱甲类似物，(±) — 8,15 — 二氢 — 去 — 11,15 — 二甲基 — 8 — 羟基石杉碱甲，(-) — 14 — 去甲基石杉碱甲，其抑制活性是石杉碱甲的1/8，这些类似物的抑制活性均小于石杉碱甲，且发现能与乙酰胆碱酶形成氢键的基团是提高其乙酰胆碱酶抑制活性的重要基团。陈凯先[50]等人用两种方法合成了(±) — 14 — 氟石杉碱甲(6)，其乙酰胆碱酶抑制活性是石杉碱甲的1/62。

5 研究展望

石杉碱甲作为一种有潜力的治疗老年痴呆药物，其相关研究越来越被关注。然而，石杉碱甲在植物中含量有限，且与成分复杂、结构类似的共生生物碱共存于植物体中，所以运用常规方法想获得大量的天然石杉碱甲相当困难，因而促使人们从多个方面研究获取的途径。自1985年以来，国内外已经提出了多种化学合成石杉碱甲的方法，但化学合成存在难以克服的局限性，很难取得纯光学活性的合成物，且实验证明石杉碱甲的手性对其生物活性至关重要，(-) — 石杉碱甲抑制乙酰胆碱酯酶活性的能力几乎是其外消旋混合物的2倍，是(+) — 石杉碱甲的33倍[51]。所以，生物合成石杉碱甲可持续生产是最值得期待的生产途径。已有研究结果基本证明，蛇足石杉天然资源及其再生能力非常有限，因此组织细胞培养、产石杉碱甲内生菌筛选、产石杉碱甲植物资源人工快繁和栽培均是值得深入研究开发的有效途径。而石杉碱甲生物合成机理的研究则是相关最关键的基础，其研究进展将关系到从分子生物学水平进行相关调控、育种、石杉碱甲生物合成异源表达工程菌的构建、石杉碱甲有机合成关键步骤生物转化的结合等，但目前最快捷、有效的途径仍然是如何通过各种方法实现蛇足石杉或其它高产石杉碱甲植物的快速、大量再生增殖。

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ResearchprogressinHuperziaserrataandHuperzineA

ZHA Chong1, DU Yatian1,2, LIU Jiao1

(1.Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering，JishouUniversity, Zhangjiajie 427000, China；2.Hunan Co-Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Zhangjiajie 427000, China)

This review mainly summarized research progress inHuperziaserrataand its medicinal active components Huperzine A, and the most effective and convenient approach to solve the source of raw materials to produce Huperzine A is large-scale, efficient regeneration proliferation ofH.serrataand natural plant resources there are higher content of Huperzine A in the recent.

Huperziaserrata; Huperzine A; endophytes;synthesis

2016-01-13

查 冲(1992-)，女，陕西省西安市人，在读硕士，研究方向为林产资源工程。

杜亚填(1962-)，男，湖南省龙山县人，硕士生导师，副教授，研究方向为植物细胞培养工程。 E-mail：duyatian 6688@163.com。

R 282

A

1003 — 5710(2016)02 — 0126 — 06

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2016. 02. 024

(文字编校：杨 骏)