杜仲生物技术育种研究进展

刘慧敏， 杜红岩， 乌云塔娜

(1.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心， 河南 郑州 450003；2.国家林业局 杜仲工程技术研究中心， 河南 郑州 450003)

杜仲生物技术育种研究进展

刘慧敏1，2， 杜红岩1，2， 乌云塔娜1，2

(1.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心， 河南 郑州 450003；2.国家林业局 杜仲工程技术研究中心， 河南 郑州 450003)

从杜仲组织培养、遗传多样性、性别相关分子标记、全基因组测序及遗传连锁图谱构建、功能基因和转基因方面对杜仲生物技术育种研究进展总结了杜仲生物技术育种研究进展，并指出了存在的问题及今后的发展方向。

杜仲； 生物技术； 育种； 进展

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)属于杜仲科，该科仅1属1种。杜仲树皮作为传统的中药材已有2 000多年的历史，有很高的经济价值，其主要药理功能为降血压、强筋骨、增强肝肾功能和安胎[1-3]。除去木质部，杜仲全株都含有白色丝状物质—杜仲胶，是天然橡胶的同分异构体，为重要的化工原料。此外，由于杜仲适生范围广，病虫害少，也是很好的园林绿化及水土保持树种，具有较高的生态效益。

随着生物技术在林木上的发展，我国已有20多种林木转基因成功[4]。杜仲的常规育种已取得了较大的进展，为了加快杜仲优良品种的育种进程，本文综述了杜仲的生物技术育种研究成果，以期为常规育种与分子育种相结合提供理论参考。

1 杜仲组织培养

杜仲的组织培养研究始于20世纪80年代，左春芬[5]等用杜仲幼嫩树枝诱导出愈伤组织。Zhang[6-7]利用杜仲未成熟的木质部和韧皮部离体培养出愈伤组织。1988年，张朝成[8]首次报道了用杜仲腋芽作为外植体培养出完整的植株。同年，芮和恺[9]将杜仲下胚轴离体培养出愈伤组织，并诱导其分化出芽。王秀松[10]等于1994年采用杜仲下胚轴和子叶诱导得到了大量的胚性愈伤组织并再生了小植株。 90年代的科研工作者相继进行了以杜仲茎尖、枝条为外植体的微繁研究[11-13]，愈伤组织的超低温保存[14]，以及愈伤组织中有效成分及胶含量的测定[15-17]。21世纪至今，科研工作者在前人研究的基础上对杜仲的组织培养做了更深入和全面的研究，蒋祥娥[18]等发现谷氨酰胺能促进培养基中不定芽的分化。李琰[19-21]等研究了外植体的种类、大小和采样时间，试验接种方式，光照条件，培养基pH值，以及植物生长调节剂对杜仲愈伤组织和丛生芽的诱导等。邱晓芳[22]建立了杜仲的摇瓶悬浮培养体系，并测定了培养过程中主要次生代谢物的含量。李俊红[23]以幼嫩叶片为外植体，对杜仲再生体系进行了优化并用秋水仙素诱导出43株多倍体植株。 2010年，唐亮[24]以杜仲的成熟胚为外植体通过直接和间接器官发生途径均获得了杜仲的再生植株，研究了其生根、炼苗和移栽过程，并以未成熟胚为外植体，获得了胚性愈伤组织。王征[25]在唐亮的研究的基础上，优化了杜仲组织培养体系，建立了以愈伤组织诱导、愈伤组织诱导丛生芽、壮苗生根路线为基础的植株再生体系。日本学者报道了利用杜仲的下胚轴高效地培养出杜仲的再生植株[26]。

尽管前人已经做过很多研究，目前杜仲组织培养仍然存在一些问题，在其初代培养时污染率相对较高，芽的诱导率低[27]。由于杜仲的胚状体发生体系还未建立，因此通过胚状体途径育苗并将其工厂化仍需科研工作者进行更多的探索。

2 杜仲遗传多样性研究

遗传多样性是保护生物学研究的核心之一，了解物种的遗传多样性对制定长期保护策略、育种和性状的改良都有重要的意义。杜仲的遗传多样性研究最初是由张檀[28]等对采自贵州、陕西等地的38个杜仲的无性系进行的酯酶同工酶分析。之后，郭军战[29]于1996年根据当时杜仲资源利用的现状，提出了杜仲遗传多样性保护的意义和途径，并分析了杜仲育种的多目标特征和主要育种方式。21世纪随着分子生物学的高速发展，我国的科研工作者相继建立了RAPD、ISSR、SSR、ScoT等分子标记反应体系[30-35]，研究了杜仲的遗传多样性，为分子标记辅助育种的技术在杜仲育种研究中的应用提供了技术支撑。武汉植物园先后用cpSSR、AFLP和SSR研究了全国范围杜仲9个栽培群体和一个半野生群体共582分样品的遗传多样性[36-37]，结果表明，杜仲群体间的遗传多样性较群体内的遗传多样性低，表明杜仲群体间的基因交流较频繁，半野生状态下的神农架群体的遗传多样性高于其他栽培群体，表明人为活动降低了杜仲的遗传多样性，贵州遵义群体的遗传背景较为单一，应该优先保护。其他基于EST _SSR和基于全基因组的SSR[38-39]等分子标记对全国杜仲遗传多样性的结果均表明杜仲群体间的基因交流比较频繁，与武汉植物园的结果一致。

以上杜仲的遗传多样性分析表明我国杜仲资源混杂，遗传多样性较低，应结合形态指标及生理特性研究，提出杜仲的保护策略，建立杜仲核心种质资源库，并加强对遗传背景较单一地区杜仲的保护和半野生杜仲群体的深入研究，从而挖掘优良的基因资源。

3 杜仲性别相关分析标记

杜仲为严格的雌雄异株植物，在幼年期仅凭形态指标难以鉴定其性别，开发杜仲性别相关的分子标记能够为杜仲种质资源在幼苗时期的合理配置提供理论依据，并为生产实践提供指导。WenJie Xu[40]发现了一段569 bp的RAPD标记仅存在于雌株，用Southern印记杂交做了验证，将其测序后设计了特异引物，合成能鉴别雌株的SCAR标记。Da-Wei Wang[41]利用64对AFLP引物组合发现一段350 bp的雄性特异引物，并将其转化为一段247 bp的SCAR引物，能够特异鉴别出雄性植株。安徽农业大学建立了杜仲ISSR-PCR反应体系[42]，并扩增出一条3000 bp的雌性特异性条带。以上研究为杜仲苗期性别选择提供理论依据和实践指导，能够大幅提高育种效率。

4 杜仲全基因组测序及遗传连锁图谱构建

中国林科院经济林研究开发中心于2014年完成了杜仲全基因组精细图的绘制，是我国第一个天然橡胶植物和世界上第一个木本药用植物的基因组精细图。西北农林科技大学[43]利用AFLP标记技术和拟测交作图策略，以人工杂交获得的F1作图群体为材料，构建出杜仲的首张遗传图谱，亲本Q1遗传连锁群包含12个连锁群，覆盖基因组总长929.57 cm，平均间距8.61 cm，亲本LF遗传连锁图含有14个连锁群，覆盖基因组总长约1116.08 cm，平均间距8.78 cm。并对重要数量性状进行了QTLs分析，找出控制杜仲叶片性状、生长性状与性别决定相关的分子标记，共检测到控制8个性状的29个QTL位点，两个与杜仲雄性相关的分子标记。杜仲全基因组物理图谱和遗传图谱的完成是杜仲研究里程碑式的进步，将对杜仲和其他药用木本植物的遗传改良、基础生物学和进化研究发挥重要的推动作用。

5 杜仲功能基因研究

随着二代测序高通量低成本的发展，转录组测序成为了解一个物种基因信息的快速有效的手段。中南林业科技大学和中国林业科学研究院经济林研究中心完成了杜仲果实和叶片的转录组测序，通过生物信息学分析和实验验证相结合，研究了杜仲MEP途径[44-45]、MVA途径[46]、橡胶合成[47]、绿原酸生物合成[48]、黄酮类生物合成[49]、a-亚麻酸生物合成[50]相关的基因特征及表达模式。贵州大学构建了杜仲树皮的cDNA文库[51]，并在此基础上克隆了EuFLC1、EuCGT1和EuCAD基因并进行了序列分析[52-54]。

国外研究者也做了相关的研究，Ren Chen[55-56]通过在杜仲不定根中过表达IPPI和FPPS1基因，从10个候选看家基因中筛选出能够衡量IPPI和FPPS1表达量变化的两个最优看家基因ACTα和EF1α，并发现过表达IPI基因，不定根中的反式聚异戊二烯的含量有明显的提高。Nobuaki[57]构建了杜仲茎外周组织和内周组织cDNA文库，发现了与胶合成相关的同源基因，并通过酵母突变体验证了6条参与MVA途径的基因的功能。

6 杜仲转基因研究

功能基因的发掘为杜仲的转基因育种奠定了基础，近年来国内外科研工作者也进行了杜仲的转基因研究。贵州大学通过农杆菌介导法，将EuFPS基因导入杜仲中，并研究了ipt基因对杜仲遗传转化的影响[58-59]。中南林业科技大学[47]通过在杜仲树皮中过表达EuTIDS5和RNAi干扰EuTIDS5表达，发现过表达处理比对照胶丝增多2.5倍，RNAi处理的胶丝仅为对照的1/2，认为EuTIDS5为杜仲橡胶合成关键酶基因。

7 存在的问题及展望

如上所述，杜仲生物技术育种研究已经取得了一定的进展，但仍存在着一些问题：(1)在杜仲遗传转化、细胞悬浮培养、原生质体培养、花药培养和离体胚培养等的研究利用方面，仍未建立起一套可操作性强、行之有效的技术体系。(2)缺乏基因的高效发掘技术，实用分子标记较少，许多重要目标性状基因尚需紧密标记，还缺乏品质、产量、抗性等协调改良的高效育种技术。

今后的杜仲育种工作应加强常规杂交育种技术与现代生物技术的有机结合。提高杜仲细胞悬浮培养、离体胚培养等技术的效率。在杜仲全基因组测序的基础上高效挖掘目标性状基因，构建密度更大的遗传图谱，对重要性状进行精细定位，开发实用分子标记，进行杜仲经济性状的早期选择从而提高育种效率。提高杜仲转基因的效率，并加强其可操作性。

总之，随着杜仲产品的开发利用，对其进行多目标育种。应根据不同的育种目标，紧密结合常规育种和生物技术育种技术，选育出具有更多具有广阔化市场前景的优良品种。

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AdvancesinresearchonbiotechnologybreedingofEucommiaulmoides

LIU Huimin1，2， DU Hongyan1，2， WUYUN Tana1，2

(1.Non-timber Research and Development Center of CAF， Zheng zhou 450003， China； 2.The Eucommia Engineering Research Center of State Forestry Administration， Zheng zhou 450003， China)

The present situation，limitation，and outlook in research on biotechnology breeding concluding tissue culture，genetic diversity，sex-linked marker，whole genome sequencing，genetic linkage map，functional gene，and transgene were summarized in this article.This paper also offered a basic reference for the combination of conventional and molecular breeding ofEucommiaulmoides.

Eucommiaulmoides； biotechnology； breeding； advance

2016-01-27

国家十二五科技支撑计划(2012BAD21B0502)。

刘慧敏(1989-)，女，河南省辉县市人，博士研究生，研究方向为林木遗传育种。

乌云塔娜(1975-)，女，内蒙古通辽市人，教授，主要从事经济林育种与栽培的研究。E-mail：tanatana@163.com.

Q 949.751.5； S 336

A

1003 — 5710(2016)02 — 0132 — 05

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2016. 02. 025

(文字编校：杨 骏)