美国沃伦·阿尔波特基金奖概览(下)

朱安远,郭华珍

(1.北京金自天正智能控制股份有限公司 市场营销中心,北京 100070；2.中国康复研究中心北京博爱医院 康复评定科,北京 100068)

美国沃伦·阿尔波特基金奖概览(下)

朱安远1,郭华珍2

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在美国颁发的知名国际生物医学大奖中,沃伦·阿尔波特基金奖的权威性和名望声誉仅次于享有“诺贝尔奖的风向标”之盛誉的拉斯克奖,1987年以来阿奖共颁发过28届(1990年未颁奖,2008年和2009年合为1届颁奖),获奖者共计59人(其中女性得主5人,尚无双料得主和组织机构得主),其中诺奖得主8人,拉奖得主18人。2011年和2015年中国中医科学院首席研究员屠呦呦先后摘取拉斯克临床医学研究奖和沃伦·阿尔波特基金奖,这是她日后最终成功问鼎诺医奖的前奏曲,屠呦呦先生接连斩获3项世界级大奖,从而锁定了她在医学科学界的“青蒿素之母”的崇高地位。对生命科学领域当今炙手可热的基因组编辑技术CRISPR-Cas9的发展轨迹及其发明专利权之争予以概括性介绍。

哈佛大学；哈佛医学院(HMS)；沃伦·阿尔波特基金会；沃伦·阿尔波特基金奖(WAFP/AFP,阿奖)；拉斯克奖(拉奖)；拉斯克基础医学研究奖(LBM)；拉斯克临床医学研究奖(LCM)；诺贝尔奖(诺奖)；诺贝尔自然科学奖；诺贝尔生理学或医学奖PM(诺医奖)；诺贝尔化学奖CH(诺化奖)；诺贝尔和平奖PE(诺和奖)；屠呦呦；青蒿素；基因组编辑技术CRISPR-Cas9；发明专利权

5 基因组编辑技术CRISPR-Cas9与沃伦·阿尔波特基金奖及其发明简史[1～5]

微生物分为真核类、原核类和非细胞类(如各种病毒)三大类。在生物学家们的显微镜下,酵母细胞是真核生物的代表,大肠杆菌则是原核生物的代表。日本分子细胞生物学家大隅良典(2016PM)通过对酵母细胞的深入研究,“因他发现细胞自噬的机制”而独享2016年诺贝尔生理学或医学奖。

糖类(曾称碳水化合物,如粮食中的淀粉)、蛋白质、脂肪和核酸是构成生命体的四大类大分子有机物(高分子化合物)。

基因(gene,即遗传因子)是控制生物性状的基本遗传单位,是指具有遗传效应的脱氧核糖核酸(DNA)片段,部分病毒(如烟草花叶病毒和艾滋病毒HIV等)的遗传物质则是核糖核酸(RNA)。基因支撑着生命的基本构造和性能,储存着生命的种族、血型、孕育、生长和凋亡等过程的全部信息。

在分子生物学和分子遗传学领域,基因组编辑(又称基因组剪接、基因组修饰、基因组加工,genome editing)技术是一种可以在基因组水平上利用特异性核酸酶对目标DNA序列进行定点修饰加工的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶EEN(内切酶的全称是限制性核酸内切酶,又称限制性核酸酶,engineered endonuclease)作介导,在预定的基因组位置切断DNA,被切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统的修复过程中会产生突变,从而达到定点编辑改造目标基因组的目的。核酸酶引起的DNA双链断裂DSB(double-strand breaks)可通过以下2种不同途径予以修复：非同源末端连接NHEJ(non-homologous end joining)和同源重组型修复HDR(homology directed repair),由此基因组编辑技术可实现以下3种基因组改造目的：基因敲除、特异突变的引入和定点转基因。

1989年首例采用同源重组HR(homologous recombination)技术产生的基因打靶小鼠(Mus musculus)问世,这是2007年诺医奖的获奖成果。虽然HR技术在小鼠模型中被广泛使用,但这项技术效率很低且在大部分物种中难以推广应用。[6]

2016年3月9日阿奖官网发布公告,将当年沃伦·阿尔波特基金奖授予以下对基因组编辑技术CRISPR-Cas9做出开创性基础贡献的5位科学家：①美国北卡罗来纳州立大学的法国微生物学家巴兰古(Rodolphe Barrangou,1975—)；②UCB美国女生物化学家杜德娜(Jennifer Anne Doudna,1964—)；③杜邦法国公司的法国营养和健康专家霍瓦特(Philippe Horvath,1970—)；④维尔纽斯大学生物技术研究所的立陶宛生物化学家斯克尼斯(Virginijusikšnys/Siksnys,1956—)；⑤马克斯·普朗克感染生物学研究所(柏林)和瑞典于默奥大学的法国女微生物学家、遗传学家和生物化学家卡彭蒂埃(又译为卡彭蒂耶、夏庞蒂埃、夏邦杰,Emmanuelle Marie Charpentier,1968—),表彰“他们对CRISPR细菌防御系统的认识及其适用于基因组编辑的革命性发现做出卓越贡献”(for their remarkable contributions to the understanding of the CRISPR bacterial defense system and the revolutionary discovery that it can be adapted for genome editing)。哈佛医学院院长兼阿尔波特基金会科学顾问委员会主席弗莱尔说“这5位科学家极具变革性的洞察力带来了一项为全球所迅速拥抱的技术,改变了我们研究和理解真核生物遗传学的方式,为开发新的基因和细胞疗法提供了巨大的潜力”。霍瓦特和巴兰古发现细菌通过一种被称为CRISPR的系统切掉入侵病毒的DNA特定片段来保护自己,避免遭受病毒等病原体的破坏；杜德娜、卡彭蒂埃和斯克尼斯则在他们发现的基础上,认识到CRISPR系统可在包括人类等众多生物体的任意基因序列上进行编程,这一极具目的性的“剪接”可用来随意改变或替换靶向DNA。CRISPR技术的优化者和延展应用者(如张锋和切奇等)则无缘阿奖。此前,UCB霍华德·休斯医学研究所(Howard Hughes Medical Institute)和劳伦斯伯克利国家实验室(Lawrence Berkeley National Laboratory)的杜德娜以及德国感染研究赫尔姆霍茨中心(Helmholtz Center for Infection Research)和瑞典于默奥大学的卡彭蒂埃因这一贡献已共享2015年度生命科学突破奖(Breakthrough Prize in Life Sciences,每年颁奖1次,始颁于2013年,因其奖金高于诺奖而被誉为“豪华版诺贝尔奖”),她俩将均分300万美元奖金,其获奖理由是“因利用细菌免疫性的古老机制而开发出基因组编辑这样的一个强大而通用技术,具有广泛的跨生物学和医学意义”(for harnessing an ancient mechanism of bacterial immunity into a powerful and general Technology for editing genomes,with wide-ranging implications across biology and medicine)。卡彭蒂埃/杜德娜还被列入2015年度化学领域的汤森路透引文桂冠名单(Thomson reuters citation laureates,始于1989年,素有“诺贝尔奖的风向标”之称)。

5.1 CRISPR系统的发现

科研人员后来通过文献检索追溯才发现,早在1987年日本大阪大学微生物学家和分子生物学家石野良纯(Yoshizumi Ishino,1957—)小组在克隆K12大肠杆菌碱性磷酸酶同工酶(alkaline phosphatase isozyme=iap)的基因编码序列时,就意外地发现编码序列附近存在特殊的串联间隔重复(5个)的DNA片段,每个重复片段含29个保守碱基且具有内部碱基互补的回文结构,这些保守片段之间由32个碱基的居间序列隔开,当时人们对这种结构的生物学功能还是一无所知。[7]1993年西班牙阿利坎特大学微生物学家马丁内斯·莫奇卡(Francisco Juan Martínez Mojica,1963—)小组在对地中海极嗜盐菌(Haloferax mediterranei)和沃尔卡尼极嗜盐菌(Haloferax volcanii)的研究中发现了这种串联间隔重复序列[8～9],1990年代中后期科学家们陆续发现这种类似结构广泛存在于古细菌和细菌的基因组中(现有基因测序结果表明,约90%的古细菌纲和40%的细菌纲的基因组或质粒中至少存在1个CRISPR位点/基因座,有的甚至含有2个或3个位点),2000年称其为短规律性间隔重复SRSR(short regularly spaced repeat)序列[10],2002年荷兰乌得勒支大学扬森(Ruud Jansen)等人将其正式命名为成簇规律性间隔短回文重复CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)序列[11],它构建一种特殊的防御系统,能有效地抵抗噬菌体和外界各种基因元件(如质粒)对其造成的干扰。CRISPR因其在结构上的特殊性和在功能上的特异性正逐渐成为细菌研究领域的热点。[12]在研究CRISPR序列过程中还发现许多与这些序列功能存在关联的核酸酶或螺旋酶,统称为CRISPR—相关因子Cas(CRISPR-associated),从而在细菌中鉴定出一个全新的CRISPR-Cas系统。

5.2 CRISPR系统生物学功能和免疫机制的阐明

因缺乏病毒和质粒的序列信息,初期对CRISPR系统的研究进展缓慢,其行使的确切功能一直未能阐明。随着测序技术和生物信息学的发展,2005年3个研究小组都发现CRISPR的居间序列(spacer)并非细菌自身染色体所拥有,反而和细菌病毒(噬菌体)以及染色体外DNA(质粒)序列更为相似,即与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源。据此科学家们推测CRISPR-Cas的功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的适应性防御系统(免疫系统)有关：细菌通过特定方式获取噬菌体DNA片段并将其整合到自身CRISPR序列,从而对外源入侵病毒产生“记忆”,当噬菌体再次感染时,细菌利用这些序列信息来识别入侵者并将其破坏。[13]

2007年法国科学家霍瓦特和巴兰古小组在研究生产酸奶的乳酸杆菌对噬菌体的抗性时首次发现并证明了细菌可利用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵。[14]他们在研究中发现：感染烈性噬菌体后的细菌大部分死亡,保留下来的“幸运”细菌则获得对同株噬菌体再次感染的抗性。对这些细菌基因组分析发现其CRISPR居间序列中存在噬菌体序列,去除这些序列可造成细菌噬菌体抗性消失；而将这些序列直接整合到未感染过噬菌体的细菌CRISPR,则细菌对首次噬菌体感染也拥有抗性,从而证实了CRISPR居间序列的重要作用。进一步的研究还发现,细菌获得抗性的原因在于具有内切酶活性的Cas蛋白可特异性地将与居间序列互补配对的噬菌体DNA双链在特定位置切开,从而造成噬菌体DNA双链断裂,以消除潜在威胁。[15]他们的突出贡献是发现了Cas7和Cas9(Cas protein-9 nuclease,一种分子质量很大的多功能蛋白,由crRNAs介导在DNA中产生的DSB。在早期的CRISPR文献中,如今大名鼎鼎的Cas9曾被称作Cas5或Csn1)蛋白在CRISPR中的重要作用：Cas7产生间隔和重复序列,Cas9则是内切酶(核酸酶)。通过一系列研究表明CRISPR-Cas是一种全新的细菌获得性免疫系统,细菌通过该系统可实现自我保护,这一现象的直接用途就是通过改造细菌基因组而获得抵抗噬菌体能力,减少工程菌死亡,而更为重要的用途则是随后发明的基因组编辑技术。因CRISPR系统在食品发酵工业和医学中的巨大潜在价值而使其迅速成为研究热点。

2008年科学家们又发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移, 首次利用实验验证了CRISPR系统的底物是DNA, 进一步明确了其作用机制, 并意识到它可能被应用于DNA编辑。[16]

CRISPR系统同时具有“搜索”和“摧毁”2种机制：使用遗传物质RNA来寻找特定序列的DNA,同时使用Cas9中的内切酶来剪接DNA。CRISPR系统介导的免疫机制分为3个阶段：获得(acquisition)、表达(expression)和干扰(interference)。获得阶段又称信息处理阶段,后2个阶段又合称执行阶段。

5.3 CRISPR-Cas9基因组编辑技术的发明

卡彭蒂埃的研究重点是感染性疾病分子生物学,她更多地关注细菌抵御病毒侵染的分子机制,CRISPR-Cas系统被发现后,其研究小组迅速投入该研究领域,他们初步阐明CRISPR来源RNA(CRISPR-derived RNA=crRNA)的生成和作用,发现一种反式激活crRNA(trans-activating crRNA=tracrRNA)可与Cas蛋白参与RNA酶Ⅲ,对CRISPR转录生成序列的选择性酶切而产生crRNA,随后Cas蛋白、tracrRNA和crRNA形成的复合物可对与crRNA配对的外源DNA实施剪接。[17]杜德娜的主要研究方向是RNA介导基因调节的分子机制,她拥有完美的学术生涯：1989年以核酶(ribozyme)方面的论文《面向RNA复制酶的设计》(TowardsthedesignofanRNAreplicase)获哈佛大学生物化学PhD,其博导是“因发现端粒酶和端粒保护染色体的机理”而荣获诺医奖的哈佛大学医学院和霍华德·休斯医学研究所的加拿大和美国(双重国籍)生物学家绍斯塔克(Jack William Szostak,1952—,2009PM33)；其博士后指导教师则是因“独立发现RNA的生物催化作用(即核酶)”而荣获诺化奖的科罗拉多大学的美国生物化学家切赫(Thomas Robert Cech,1947—,1989CH22)。杜德娜的优势在于拥有坚实的分子生物学、结构生物学和生物化学等研究基础。2007年杜德娜小组开始研究CRISPR-Cas系统,重点在于阐明Cas酶催化、crRNA形成和靶位DNA双链断裂过程中的结构基础和分子机制。[18]

2011年斯克尼斯小组在大肠杆菌中重组了嗜热链球菌的CRISPR系统,证实该系统的充分必要组分包括Cas9核酸酶、crRNA和tracrRNA。[19]至此细菌获得性免疫系统CRISPR-Cas的作用机制被基本阐明,CRISPR系统被证实可用作准确和高效的基因组编辑工具,从而为其进一步的实际应用奠定了坚实基础。CRISPR-Cas发挥作用主要分为3个步骤：①外源DNA部分短序列作为间隔序列插入到细菌染色体DNA而形成CRISPR；②CRISPR转录生成crRNA前体,借助RNA酶Ⅲ完成crRNA加工成熟；③crRNA区间序列与外源DNA互补配对启动Cas蛋白催化的DNA剪接。科学家们在研究中共发现存在3类CRISPR-Cas系统,其中Ⅱ类系统最为简单,只需要一种Cas蛋白(即Cas9)就可完成DNA的识别和剪接,更适宜于实际操作。

CRISPR-Cas系统与细菌限制—修饰系统的发现和应用过程具有异曲同工之妙。限制—修饰系统是细菌对自身DNA进行修饰(甲基化),对外源DNA则借助限制性内切酶识别(不识别修饰后的自身DNA)和剪接而抵御感染。后来发现也存在3类限制性内切酶,而Ⅱ类内切酶由于识别和剪接在相同位置而被广泛应用。发现限制性内切酶及其在分子遗传学方面的应用是1978年诺医奖的获奖成果,而利用限制性内切酶首次实现DNA重组则是美国生物化学家保罗·伯格(Paul Berg,1926—,DNA重组技术之父,1980CH31●)荣获诺化奖的研究成果。

2011年5月卡彭蒂埃和杜德娜在波多黎各召开的美国微生物学会会议上相识,研究方向的一致性和研究内容的互补性使她俩决定强强联手,密切合作进行细菌CRISPR-Cas系统应用于DNA编辑的深入研究,果然2012年便率先取得重大突破：[20]联合小组对天然CRISPR-Cas系统在体外进行适当改造(重组),将tracrRNA和crRNA双组分利用基因工程整合为一条链,称为单链介导RNA(single guide RNA=sgRNA)。改造后用于特定DNA编辑技术的CRISPR-Cas9基本原理是：sgRNA与靶位DNA相应序列互补配对可启动内切酶Cas9的双链剪接活性,Cas9中的HNH核酸酶结构域负责剪接sgRNA互补链DNA,RuvC样结构域则负责剪接非互补链DNA。卡彭蒂埃/杜德娜联合小组在试管内利用II型CRISPR-Cas系统首次实现了目的DNA特定位点的DSB,为CRISPR-Cas系统应用于基因组定点编辑奠定了基础,开辟了一个全新领域,这项重大突破便成为CRISPR-Cas9技术发明史的一个重要里程碑。实际上斯克尼斯小组稍早一点已取得类似结果,2012年4月6日他们投稿于《细胞》杂志,6天后被拒稿(事后《细胞》杂志编辑部承认此文确实很重要),作者将文稿压缩后的精炼版于5月21日改投PNAS并被发表。[21]2013年卡彭蒂埃/杜德娜联合小组进一步利用CRISPR-Cas9技术在细胞内实现DNA精确定位编辑,随后迅速引发井喷式发展,通过改造还可实现基因表达的激活或抑制调控。[22]

CRISPR-Cas9技术不仅可用于探索生命奥秘，而且其应用领域宽广，商业前景十分广阔，包括细胞和动物模型建立、功能基因组筛选(如修改奶牛基因提高产奶量和修改植物基因提高抗虫性等)、基因转录调节表观调控、细胞基因组活性成像和靶向基因治疗等。[23]因其技术本身存在脱靶效应,在临床应用安全性方面尚待进一步完善和改进,但其强大的作用效果将为单基因甚至多基因遗传病治疗(基因疗法)提供全新模式。

5.4 CRISPR-Cas9技术的发明专利权之争

生命科学领域国际三大知名学术期刊是指美国《细胞》(Cell)、英国《自然》(Nature)和美国《科学》(Science),合称CNS。2016年1月14日,《细胞》杂志发表麻省理工学院(MIT)教授、博德研究所(Broad Institute,由MIT和哈佛大学合作创办于2004年)所长、国际基因测序先驱、数学家和遗传学家埃里克·兰德(Eric Steven Lander,1957—)关于基因组编辑技术CRISPR发明历程的综述文章《CRISPR英雄谱》,重点介绍这一技术发展史上重要节点的科学家群英榜。[24]该文的发表引起轩然大波,在美国生命科学界引发一场激辩,纷争和异议不断,业内不少人认为该文有失客观和公正。

2011年9月16日美国总统奥巴马签署对专利法进行全面修订的《美国发明法案》,其生效日期2013年3月16日是美国专利系统的一个关键时间节点。此前,美国专利和商标局(USPTO/PTO)授予发明专利权实施“发明优先”原则,此后则实施“申请(提交)优先”原则。若申请日在2013年3月16日之后,但发明时间早于这一天,发明专利权的归属则依照旧规则执行。

博德研究所美籍华裔生物学家张锋(Zhang Feng,1982—,自述迟至2011年2月尚不知CRISPR为何物)首次使用CRISPR系统实现了对人类和哺乳动物细胞的DNA编辑。[25]同期杂志还发表了1篇得到类似结果的文章,其领衔者(通讯作者)是哈佛大学美国遗传学家、分子工程师和化学家切奇(George McDonald Church,1954—)。[26]稍后杜德娜小组亦发表类似结果。[27]

近年来,张锋所在的博德研究所/MIT和杜德娜所在的UCB霍华德·休斯医学研究所就CRISPR技术的相关专利权归属问题展开激烈争执。2014年4月15日USPTO依照所谓“发明优先”原则将CRISPR技术的首项相关专利权授予博德研究所/MIT的张锋而不是早于2013年3月15日便提交申请的杜德娜/卡彭蒂埃[28],不少人认为出现这种结果的一个重要的原因就是博德研究所的专利律师申请了快速审查(fast-track patent)而抄了近道。为了支持自己获取发明专利权,张锋表示他对杜德娜/卡彭蒂埃小组的工作知之甚少(2011年2月时张锋对CRISPR技术还一无所知),并提交实验室笔记本的照片,以证明自己在2012年年初就开始了这方面的研究工作,时间上要早于对方。截至2015年11月,张锋实验室和博德研究所关于CRISPR-Cas9技术的相关专利权在美国已有14个获得授权,在欧洲亦有4个被批准,控制着CRISPR技术的每个重要商业应用。

UCB经精心准备之后,于2015年4月请求USPTO启动干预程序,重新审核CRISPR技术首项相关专利权的归属,此请求已于翌年1月获得同意,3月10日干预程序正式启动,这意味着双方又站在了同一起跑线上,都需要拿出最强有力的证据来证明自己就是CRISPR技术的第一发明人。在启动重新审核专利权的节骨眼上,深陷发明专利权苦战的张锋略显意外地落选阿奖,这无疑又是一记沉重打击,很可能为这场争执埋下不利伏笔甚或是祸根,笔者认为杜德娜/卡彭蒂埃一方翻盘的可能性很大。

5.5 基因组编辑技术的新突破及质疑

CRISPR-Cas9是继锌指核酸酶ZFN(zinc-finger nuclease,2002年首次应用于敲除目的基因)和转录激活因子样效应物核酸酶TALEN(transcription activator-like effector nuclease,2011年成功应用于目标基因的编辑[29])之后问世的第3代人工核酸酶和基因组编辑技术,被誉为基因组编辑的一把“魔剪”。与前两代技术相比,它具有成本低、制作简便和快捷高效等优点,因其拥有无可比拟的技术优势而迅速风靡于世界各地的生命科学实验室,人类的诸多遗传性疾病有望通过CRISPR-Cas9技术而得以解决。

2016年5月2日,河北科技大学(石家庄)生物科学与工程学院副教授韩春雨[通讯作者,1974年出生于石家庄,1996年本科毕业于河北师范大学生命科学学院,2000年获中国农业科学院作物遗传育种专业硕士学位,2003年获中国协和医科大学(2007年起已更名为北京协和医学院)生物化学与分子生物学ScD。其主要合作者沈啸系浙江大学医学院基础医学系研究员]小组在国际顶级期刊英国《自然·生物技术》杂志在线发表论文《利用格氏嗜盐碱杆菌的Argonaute蛋白实现DNA介导的基因组编辑工具》[30],他们另辟蹊径,利用古细菌——格氏嗜盐碱杆菌中的一种Argonaute蛋白作为内切酶,采用短链单链DNA作介导,发明一种对基因组位点编辑范围更广更精准的基因组编辑新技术NgAgo-gDNA(NgAgo=Natronobacterium gregoryi Argonaute),它不同于以RNA作介导的CRISPR-Cas9-sgRNA技术,可真正实现对基因组的任意位置进行剪接,将基因组编辑技术的可能性推进到更广泛的境地,它还规避了令人头痛的RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或脱靶效应,其性能优于当今西方的热门技术CRISPR-Cas9,该研究成果打破了外国基因组编辑技术的发明专利垄断,实现了中国尖端生物技术原创零的突破。

2014年2月韩春雨偶然阅读到荷兰瓦格宁根大学(Wageningen University)科学家小组在《自然》杂志发表的论文报道TtAgo(Thermus thermophilus Argonaute)可在高温条件下体外切割DNA(该项成果已申请英美和PCT国际专利)[31]，受此启发才着手利用Argonaut进行相关课题研究。

2015年12月21日，韩春雨小组的相关研究申请了题为“以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术”的中国专利(专利权人：浙江大学，发明人：沈啸、韩春雨，申请号：CN201510971234.5，公开号：CN105483118A，公开日：2016.04.13，国际专利分类IPC号：C12N15/10)，2016年5月11日该专利已进入实质审查阶段。该项成果尚未申请包括PCT国际专利在内的国外专利。

2016年6月30日,著名科普作家、学术打假斗士和中国独立新闻人的先驱方舟子先生(原名方是民,1990年获中国科学技术大学生物系BSc,1995年获美国密歇根州立大学生物化学PhD,曾先后在美国罗切斯特大学生物系和索尔克生物研究院做博士后研究,研究方向是分子遗传学)在网络上公开发文质疑韩春雨小组所谓“诺贝尔奖级”实验成果存在“不可重复性操作”问题,怀疑该科研成果的可靠性和真实性。[32]国内外实验室的科学家们甚至无法检测出NgAgo的内切酶活性,还有人担心韩春雨小组是否故意隐瞒了一些数据,把偶然现象当作了一种常态(即科研上的所谓假阳性结果)。

韩春雨小组论文所称可有效编辑内源性基因组的研究成果发表以后，在该领域影响很大，因NgAgo基因组编辑技术的实验始终无法重复，国内外有关专家学者纷纷提出质疑，2016年11月11日南通大学刘东小组在英文期刊《细胞研究》(中国科学院上海生命科学研究院主办)以“致编辑信”(Letter)形式在线发表《基于NgAgo的fabp11a基因敲低引起的斑马鱼眼睛发育缺陷》一文，提出NgAgo系统无法用于编辑斑马鱼基因组。[33]同年11月15日中外20名专家学者联名在英文期刊《蛋白质与细胞》(由中国科学院北京生命科学研究院、中国生物物理学会和高等教育出版社联合创办)以Letter形式在线发表《有关NgAgo的问题》一文，反映各自所在的研究小组均无法重现韩春雨小组在NgAgo论文中所述及的结果，呼吁原始论文的作者澄清NgAgo技术的不确定性。[34]紧接着，11月28日刊载韩春雨小组论文的原始期刊《自然·生物技术》以“编辑部关注”(To the Editor)形式在线发表韩德美3个独立团队10名主流科学家联名的通信论文《利用NgAgo未能检测到DNA引导的基因组编辑》[35]，他们都无法重复韩春雨小组原论文中图4的结果，这一关键图表展示了对哺乳动物细胞内源性基因位点的编辑。这些团队无一能在任何位点，或在任何高于检测方法敏感度的条件下观察到NgAgo所诱导的变异，未能检测到成功编辑靶向序列的证据。

NgAgo-gDNA新技术具有编辑对象受限更小、介导设计制作简便、特异性高和脱靶率低等明显优势,尽管该技术尚处于初级阶段，但它能否如愿发挥出其优势和潜力,蓬勃兴起并迅速占领市场,从而担当起第4代基因组编辑技术之重任,最终取代一度席卷全球的CRISPR-Cas9技术抑或与其并驾齐驱,人们现只能拭目以待,此事尚需等待时间的检验。

6 结束语

现代医学是循证医学EBM(又称实证医学、证据医学,evidence-based medicine),意即“遵循证据的医学”,其核心思想是医疗决策(即病人的处理、治疗指南和医疗政策的制定等)应在现有的最好的临床研究依据基础上作出,同时也重视结合医生个人的临床经验。循证医学不同于以经验医学为主的传统医学。

中国工程院院士樊代明先生认为人类医学经历了经验医学时代、科学医学(或称生物医学)时代,现在则是整合医学时代。整合医学HIM(holistic integrative medicine)是把全科医学、转化医学(translational medicine)、循证医学和互补医学(即补充和替代医学,包括世界各地的传统医学和民间疗法,如印度医学、催眠疗法、传统的中医药和针灸疗法等)等精髓加以整理整合而成,使之适应、符合病人的全身整体治疗,它与整体医学(holistic medicine,有学者认为它是循证医学和补充医学的结合)亦有所不同。整合医学作为新的医学体系,是未来医学发展的必然方向和必由之路。[36～37]

屠呦呦先生因发现青蒿素和双氢青蒿素的重大原创性贡献,于2011年和2015年先后摘取拉斯克临床医学研究奖和沃伦·阿尔波特基金奖,这为她稍后赢取诺医奖(2015PM31●)奠定了坚实基础。屠呦呦接连斩获3项世界级大奖,从而锁定了她在医学科学界的“青蒿素之母”的崇高地位,也使得颇受关注的青蒿素发现发明权之争终于尘埃落定。鉴此笔者认为,在不久的将来屠呦呦先生将众望所归地登顶成为国家最高科学技术奖得主。

去年学界失汤斯(Charles Hard Townes,1915.07.28—2015.01.27),今年吾家逝慈父。家父朱尧天先生(谱名：在昭,笔名：牧夫,1934.11.13今湖南省邵东县—2016.08.03深圳市龙华新区)已驾鹤西归,特谨致无限的深情哀思。对于飞秒化学之父(Father of femtochemistry)、埃及和美国(双重国籍)物理化学家和化学物理学家泽维尔(Ahmed Hassan Zewail,1946.02.26埃及Damanhur—2016.08.02加利福尼亚州帕萨迪纳市,1999CH,埃及历史上迄今唯一的诺贝尔科学奖得主,诺奖历史上的第580位逝者)以及美籍华裔生物化学家钱永健先生(Roger Yonchien Tsien,1952.02.01纽约州纽约市—2016.08.24俄勒冈州尤金市,2008CH33,钱学森先生的堂侄,首位逝世的华裔诺奖得主,诺奖历史上的第582位逝者)的不幸仙逝,特顺致深切哀悼。截至2016年9月底,已逝诺奖得主逝世于8月份者为最多(64/584人),逝世于11月份者为最少(38/584人),均值是48.67±7.95人,仅2016年8月全世界就损失4位诺奖得主,痛乎矣!悲乎哉!!

[1]郭晓强,黄卫人,蔡志明.一种全新DNA编辑工具——CRISPR-Cas9技术[J].科学通报,2015,60(30)：2833-2835.

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