牛支原体膜蛋白研究进展

李　强，赵泽慧，牛耀祖，许立华

(宁夏大学农学院，宁夏银川 750001)



文献综述

牛支原体膜蛋白研究进展

李强，赵泽慧，牛耀祖，许立华*

(宁夏大学农学院，宁夏银川 750001)

摘要：膜蛋白是牛支原体的重要结构，在牛支原体与宿主间的互作中具有重要作用。近年来，据报道牛支原体可变表面脂蛋白在病原黏附力及致病性中具有重要作用。论文主要综述了牛支原体膜蛋白和可变表面脂蛋白的研究进展，并介绍了牛支原体的黏附力以及其膜蛋白在牛支原体检测上的应用，以期为今后牛支原体膜蛋白的研究、疫苗和检测试剂盒的研发提供参考。

关键词：牛支原体；膜蛋白；黏附力

1961年，由Hale等在美国一例患严重乳房炎的奶牛中首次分离到牛支原体(Mycoplasmabovis)。在柔膜体纲下的不同分类学中，目前已认定超过100种支原体，至少20种能感染牛。其中，牛支原体是最重要的一种。在全球范围，牛支原体是造成肉牛、奶牛、犊牛一系列病症的重要病原体。牛支原体感染可引起肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎、中耳炎和生殖障碍等相关疾病，引起不可估量的经济损失[1]。

在我国，由辛九庆等人从犊牛肺脏中首次分离得到牛支原体，随后在国内多个省市均发现牛支原体感染病例[2]。随着该病的流行，牛支原体越来越受到重视，与之相关的研究日益增多。本文主要对牛支原体膜蛋白及其可变表面脂蛋白的研究进展进行综述，以期为今后牛支原体膜蛋白的研究提供参考。

1牛支原体膜蛋白

牛支原体结构相对简单，没有细胞壁，其表面聚集着大量脂蛋白，因此膜蛋白在牛支原体功能中有着重要作用，同时也是利用其作为研究膜结构和功能模型的主要原因。然而牛支原体膜蛋白与宿主之间有着复杂的相互作用关系。其细胞膜上含有的主要抗原物质是膜蛋白和糖脂，能够刺激宿主产生相应的体液免疫和细胞免疫应答[3]。目前除可变表面膜蛋白，仅有很少的牛支原体膜蛋白被鉴定。研究结果显示，一种48 ku的牛支原体膜脂蛋白p48，与发酵支原体的巨噬细胞极化脂蛋白(macrophage activating lipoprotein, MALP)具有同源性。由于牛支原体的结构和抗原的保守性，可作为感染的血清学标记。另一种68 ku的旁系同源编码的假定蛋白p68，已在牛支原体PG45克隆变异体6中被认定。p68蛋白的基因只在某些牛支原体中检测到，而这些牛支原体同时包含p48基因。因此，在所有支原体中，仅有牛支原体含有MALP的多种同系物。由于牛支原体与无乳支原体等具有较高的同源性，急需特异性蛋白用于区分和检测。目前，通过对部分牛支原体基因组测序，多数膜蛋白是由基因组序列假定预测的。因此，还有许多牛支原体膜蛋白和假定蛋白需要研究和鉴定。

2牛支原体可变表面脂蛋白

牛支原体细胞质膜含有独特的胆固醇，总蛋白含量高达50%以上。这些膜和膜相关蛋白十分重要，通常含有细胞黏附素。同细胞质膜相关的其他蛋白大多为脂蛋白，通常暴露在外环境中，通过酰基附着于细胞质膜上[4]。

牛支原体基因组的灵活性，使其具有高度可变的表面抗原，这是造成慢性感染的重要因素。PG45型菌株由13个不同的单拷贝可变表面脂蛋白(variable surface protein, Vsp)基因组成的染色体群，即Vsp基因座。该基因座大约23 kb，包含2个阅读框(open reading frame, ORF)，有较高的同源性。Vsp基因座具有双亲特性，含有脂肪酸和半胱氨酸残基[5]。Vsp基因包含保守的5′端非编码序列，分为两个基因盒，基因盒Ⅰ与全Vsp基因有99%的同源性，具有编码指定的核糖体结合位点[6]。基因盒Ⅱ处于基因盒Ⅰ的上游，具有更高的可变性。该序列跟随在一个开放阅读框之后，N末端区域与98%～99%的菌株具有一致性，包裹着载脂蛋白信号肽。而Vsp的C末端结构域，表面暴露[7]。由于Vsp基因具有高度的变异性，导致牛支原体在面对来自宿主的不同选择压力时，不断增强变异性，提高生存能力。

Sachse K等[8]已发现牛支原体可变表面脂蛋白能自发进行高频相位变化。On与Off之间表达状态的转换，是由于牛支原体染色体上DNA特殊位点的重排，根据高度同源性相位变化的机制还发现，与无乳支原体具有密切相关性。Vsp在牛支原体感染机制中有着重要作用，其变异表达和复杂结构共同决定了它的功能，可做为感染的血清学标记。同时Vsp的变异性又导致了宿主的特异性和牛支原体的慢性疾病。但是，目前的困难在于明确其复杂的结构和高度的可变性。

3牛支原体的黏附力

黏附是牛支原体侵染的第一步，因此黏附素的表达十分关键。由于基因组很小和缺少必要的生物合成途径，牛支原体先黏附宿主细胞，进行细胞膜的融合，然后相互交换细胞膜和细胞内成分。然而，在牛支原体中并未发现能够积累大量黏附素的极性结构。通常认为牛支原体黏附素几乎覆盖整个膜蛋白的表面[9]。此外，在细胞黏附实验中，添加纯化的Vsp可减少牛支原体的细胞黏附因子，并且Vsp将留存于宿主的细胞层中。Vsp通过重复域中的寡肽抑制牛支原体局部的细胞黏附因子[10]。表面抗原的变异，通过删除或嵌入Vsp的重复单元，去除或产生一些额外的抗原表位，导致细胞黏附因子的增减以及更宽或更窄范围的配体结合[11]。目前，通过研究已知牛支原体的黏附力与膜蛋白和可变脂蛋白有着密切联系，但是对于黏附素的分泌和牛支原体与宿主细胞黏附作用的机制还需进一步研究。

4牛支原体膜蛋白在检测上的应用

近年来，国内外牛支原体病的检测方法主要集中在病原体的分离鉴定、血清学检测、基因诊断三个方面[12]。传统的检测方法主要通过病原的分离鉴定判断牛支原体感染，但由于在临床实践中，牛支原体的分离经常受到其他病原菌或者抗菌药物的影响，分离较为困难并且对培养基的营养要求高，培养周期长，无法对牛支原体感染进行快速检测。PCR技术可广泛的应用于检测，但是需要对样品进行较为复杂的处理，对实验室的条件和仪器设备有一定的要求，同时需要一定的专业人员进行操作，不适用于基层和临床工作的广泛应用[13]。与这些检测方法相比，血清学检测具有方便、快捷、敏感性强等特点。其中ELISA方法、间接血凝试验(IHA)等广泛应用于实践当中，并且适用于大量样本的检测。1981年一种全菌蛋白的间接ELISA方法用于检测牛支原体抗体[14]，当然特定的目标蛋白比全菌蛋白具有更高的特异性。目前，一些牛支原体膜蛋白和脂蛋白已发展应用于牛支原体的检测和分析。

4.1牛支原体p48蛋白

该蛋白是一种48 ku的牛支原体膜脂蛋白。简莹娜等[15]优化并合成了牛支原体的p48基因，将其克隆到pET-32a表达载体上，16℃低温诱导表达，获得可溶性重组p48蛋白。将纯化后的重组p48蛋白与靴酸处理过的绵羊红细胞，建立了检测牛支原体抗体的间接血凝试验，牛支原体超免血清抗体效价达1∶2 048～1∶4 096。该方法同多种其他病原菌的阳性血清检测结果均为阴性。与国外商品化的牛支原体ELISA试剂盒相比，平均符合率为96.15%。该方法敏感性高、特异性强、重复性好，可用于牛支原体抗体水平检测及流行病学的调查[16]。

4.2牛支原体pMB67蛋白

Behrens等于PG45中鉴定了一种新膜蛋白——pMB67，是牛支原体感染的主要抗原。该蛋白是一种在Vsp上具有重要功能的可变抗原成分，但是与Vsp没有抗原性和结构上的相似性，不是Vsp家族成员[17]。pMB67位于菌体表面，是特异性单克隆抗体的特定抗原表位，与Vsp相比不包含多个重复亚单位，但与Vsp结合后能独立表达，提高了合成能力，并能保持原有的结构性、抗原性和表面功能[18]。同时重组Vsp也表现出较高的免疫活性。现已证明Vsp和pMB67能表现出多样化的表达模式，并且感染牛支原体时具有高度可变性[19]。因此，可以以混合重组型抗原为基础，建立一套灵敏的免疫分析系统，用于牛支原体感染的特异性快速检测，具有较好的发展前景。

4.3牛支原体p26蛋白

p26抗原开发的一种单克隆抗体已建立一种抗原捕获ELISA方法，能检测出牛乳样中的支原体。虽然p26单克隆抗体与无乳支原体有交叉反应，但只要无乳支原体不出现在牛奶中，并不影响牛支原体乳房炎的检测。在胚胎牛肺细胞(embryonic lung cells, EBL)中，p26蛋白对牛支原体的黏附力起重要作用[20]，p26基因的表达水平与不同菌株黏附力的相对水平相关，而单克隆抗体p26对黏附素有抑制作用。通过单克隆抗体的制备，能够有效、迅速、准确的抑制黏附作用，从而阻断牛支原体对宿主细胞的侵染。

4.4牛支原体的α化酶

牛支原体的α化酶已被证明是一种表面暴露蛋白，能通过结合纤维蛋白溶酶原黏附EBL细胞。它能作为一种纤维蛋白溶酶原的受体，有助于牛支原体在宿主体内的侵染和扩散。在对抗重组牛支原体α化酶时，抗体可在可溶性细胞质部分、细胞膜部分以及整个细胞蛋白中检测到[21]。由此可见，α化酶是一种牛支原体膜相关蛋白，在侵染宿主组织中具有重要作用。该酶分布广泛，是用于牛支原体检测的理想蛋白，但目前在蛋白酶方面的研究较少，缺乏相应的检测方法，可作为今后研发的重要方向。

5展望

牛支原体严重影响了我国乃至全球养牛业的发展，虽然距离发现至今已有半个世纪之久，但国内外对于牛支原体的研究仍没有突破性的进展。由于牛支原体没有细胞壁，其致病性高度依赖细胞质膜及其可变表面膜蛋白，它们有利于其形态性、运动性以及对宿主细胞的黏附性。然而，目前对牛支原体研究仍然有限，张利等[22]通过牛支原体的体外MIC药敏试验，发现抗生素类药物几乎没有作用，而市场基本没有商品化疫苗，所以疫苗成为今后研发的重中之重。同时对牛支原体基因组的测序和ORF的分类仍然是一项艰巨的任务，目前还没有相匹配的数据库明确ORF的功能，只能通过预测。王艳杰等[23]对牛支原体分离株全基因组进行了序列测定及初步分析，对研究其潜在的致病机制及其调控机制提供了依据。因此，要不断完善牛支原体PG45型、HB0801型和Hubei-1型菌株基因组序列的分析和鉴定。新发现的免疫原性蛋白越来越多，虽然许多预测膜蛋白还未被认定，其大部分功能也未被证明。但该举措对增进遗传特性和发病机制的理解，开发行之有效的疫苗，建立灵敏度高、特异性强、快捷方便的检测技术具有重要意义。

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Progress on Membrane Proteins ofMycoplasmabovis

LI Qiang, ZHAO Ze-hui, NIU Yao-zu ,XU Li-hua

(1.CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750001,China)

Abstract:Membrane proteins are significant structures ofMycoplasmabovis, which play an important role in the interactions with host. In recent years,many reports proved that variable surface lipoproteins may be importantly contributing in the adhesion and pathogenesis ofMycoplasmabovis. In this article, we described some research progress on membrane proteins and variable surface lipoproteins ofMycoplasmabovis. Moreover we gave a further description about diagnostic application of adhesion and membrane proteins. This article will provide a frame of help for membrane proteins research, vaccine and diagnostic kits in the future.

Key words:Mycoplasmabovis; membrane proteins adhesion

收稿日期：2015-12-02

基金项目：国家自然科学基金项目(31560687)；宁夏奶牛育种专项(2013NYYZ0501)

作者简介：李强(1991-)，男，河南郑州人，硕士研究生，主要从事预防兽医微生物研究。 *通讯作者

中图分类号:S852.62

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)06-0084-04