结核感染T细胞斑点试验对结核病治疗效果的监测价值

何紫琪，李从荣

（武汉大学人民医院检验科，湖北 武汉 430060）

结核感染T细胞斑点试验对结核病治疗效果的监测价值

何紫琪，李从荣

（武汉大学人民医院检验科，湖北 武汉 430060）

目的 探讨结核感染T细胞斑点试验对结核病治疗疗效的监测意义。方法本研究采用T-SPOT.TB试剂盒，检测T细胞中γ-干扰素对结核分支杆菌特异性多肽类早期分泌性抗原靶标6-kD(ESAT-6)和培养滤液蛋白(CFP-10)的应答，对比113例结核感染者治疗前与治疗后T-SPOT.TB结果的变化，其结果根据对该试验中两种抗原的联合与各自应答来分析。结果113例感染者在治疗后T-SPOT.TB结果转阴者有42例(37.2%)。其中，CFP-10转阴率占48.9%(P＜0.001)，ESAT-6转阴率占20.0%(P=0.238)。ESAT-6的斑点形成细胞(SFCs)/2.5×105外周血单核细胞(PBMCs)的平均数在治疗前和治疗后分别为18.47和16.29(P=0.16)，而CFP-10的SFCs/PBMCs的平均数在治疗前和治疗后分别为22.83和15.31(P＜0.01)。结论结核病治疗对于T细胞中γ-干扰素引起的ESAT-6和CFP-10抗原应答影响不同，CFP-10的定量应答才是结核病治疗的更有效监测手段。

结核感染T细胞斑点试验；早期分泌性抗原靶标6-kD蛋白；培养滤液蛋白CFP-10；结核病治疗

在有沉重结核病负担的国家，对结核感染者进行及时的鉴别诊断和治疗是一种重要的结核病控制和消除手段[1-2]。目前除了观察接受治疗患者的疾病进展，尚无试验来确定结核病治疗效果。

近来，市售的商品化T-SPOT.TB试剂盒通过酶联免疫斑点技术可将单个被激活的结核分支杆菌特异性T细胞显现出来。试验过程中过夜孵育使经结核分支杆菌抗原刺激的效应T细胞激活，若效应T细胞数量随治疗过程中分支杆菌抗原量下降而下降，那么测量分支杆菌特异性抗原应答的T细胞数即对于判定治疗的有效性有重要意义[3]。本研究即通过T-SPOT.TB试验来评价其在结核病治疗中的监测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年1月至2015年12月来我院行T-SPOT.TB检查的患者909例，其中325例患者T-SPOT.TB试验结果阳性。325例患者中238例为我院住院患者并最终确诊为结核菌感染，其中肺结核212例，骨结核18例，结核性脑膜炎3例，肠结核5例，其余患者为隐匿性结核菌感染者。剔除经≥6个月治疗后未回我院进行复诊并再次行T-SPOT.TB试验的患者，剩余113例患者纳入本次研究。

1.2 T-SPOT.TB试验 采用上海复星长征医学科学有限公司提供的试剂盒，严格按照说明书操作。结果判读：空白对照孔斑点数为0～5个时且(抗原A或抗原B孔的斑点数)-(空白对照孔斑点数)≥6，判断为阳性；空白对照孔斑点数为6～10个时且(抗原A或抗原B孔的斑点数)≥2×(空白对照孔斑点数)，判断为阳性；上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时检测结果为“无反应性”。

1.3 统计学方法 数据处理采用SPSS 17.0软件，散点图作图采用GraphPad Prism 5软件。组间比例差异的比较采用χ2检验，配对比例差异的比较采用McNemar检验，配对资料平均数的比较采用Man-Whitney U检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 113例患者治疗前与治疗后的T-SPOT.TB结果 治疗前，113例T-SPOT.TB阳性患者中ESAT-6阳性者60例(53.1%)；CFP-10阳性者90例(79.6%)。其中，仅ESAT-6阳性者23例(20.1%)，仅CFP-10阳性者53例(46.9%)，二者均阳性者37例(32.7%)。治疗后，T-SPOT.TB转阴者42例(37.2%)。剩余71例治疗后仍为阳性的患者中有22例(30.9%)仅为ESAT-6阳性，有17例(23.9%)仅CFP-10阳性，有32例(45.1%)二者均阳性(如图1)。治疗前，患者ESAT-6的SFCs/2.5×105PBMCs计数为0～84，平均值为18.47；治疗后，患者ESAT-6的SFCs/PBMCs计数为0～120，平均值为16.29。治疗前与治疗后均值经Mann-Whitney检验比较，P=0.158 9。治疗前，患者CFP-10的SFCs/2.5×105PBMCs计数为0～192，平均值为22.83；治疗后，患者CFP-10的SFCs/PBMCs计数为0～158，平均值为15.31。治疗前与治疗后均值经Mann-Whitney检验比较，差异有统计学意义P＜0.01(如图2)。

图1 治疗前与治疗后ESAT-6、CFP-10阳性例数示意图

图2 治疗前与治疗后ESAT-6、CFP-10的SFCs/PBMCs数比较

2.2 113例患者治疗前与治疗后ESAT-6、CFP-10计数 在23例治疗前仅ESAT-6阳性的患者中有6例(26.09%)治疗后转阴；在53例治疗前仅CFP-10阳性的患者中有35例(66.04%)治疗后转阴；在37例治疗前二者均为阳性的患者中有4例(10.8%)治疗后均转阴，2例(5.4%)仅ESAT-6转阴，5例(13.5%)仅CFP-10转阴，见表1、表2。治疗前，ESAT-6阳性与阴性患者所占比例分别为53.1%与46.9%；CFP-10阳性与阴性患者所占比例分别为79.65%与20.35%。治疗后，ESAT-6阳性与阴性患者所占比例分别为47.79%与52.2%；CFP-10阳性与阴性患者所占比例分别为43.36%与56.64%。经配对比例差异McNemar检验，治疗前与治疗后患者对ESAT-6应答比例差异无统计学意义(P=0.238)，而对CFP-10应答比例差异有显著统计学意义(P＜0.01)。

表1 治疗前与治疗后患者对ESAT-6应答数(例)

表2 治疗前与治疗后患者对CFP-10应答数(例)

2.3 113例患者治疗前与治疗后对ESAT-6和CFP-10应答的变化趋势 由于此斑点计数是人工判读，结果无法精确的再现，因此将计数±5SFCs/ PBMCs内的斑点数划分为“不变”。在治疗前与治疗后患者对ESAT-6应答的降低、不变、上升的比例分别为48.67%、12.39%和38.94%；对CFP-10应答的降低、不变、上升的比例分别为67.26%、6.19%和26.55%，见表3。二者经组间比例差异比较的χ2检验，得出P= 0.008，表明ESAT-6和CFP-10的应答数在经治疗后降低、不变与上升的比例差异有统计学意义，其中患者对ESAT-6应答下降的比例低于CFP-10，而不变与上升的比例均高于CFP-10。

表3 治疗前与治疗后对ESAT-6和CFP-10应答变化(例)

3 讨论

结核分支杆菌抗原特异性γ干扰素释放试验(IGRAs)是近来结核分支杆菌感染诊断领域的一项重要进展[4-5]，它所检测的是T细胞中γ-干扰素对结核分支杆菌特异性多肽的应答而产生的早期分泌性抗原ESAT-6和培养滤液蛋白CFP-10。这些抗原是由存在于所有结核分支杆菌的1号基因组差异区域编码，而非结核分支杆菌和BCG疫苗菌株不含该区域，因此该抗原具有结核分支杆菌高度特异性。我们认为，效应T细胞的数量随着治疗过程中分支杆菌抗原量(即细菌载量)的降低而下降，那么抗原计数的变化即能反映治疗的情况[6]。

本研究我们采用T-SPOT.TB试剂盒，对比113例感染者在治疗前与经治疗好转后其ESAT-6和CFP-10抗原应答数量上的差异。对于ESAT-6抗原而言，治疗前患者阳性率为53.10%，治疗后阳性率为47.79%，该下降率差异无统计学意义(P＞0.05)；但对于CFP-10抗原而言，治疗前患者阳性率为80.1%，治疗后阳性率下降为43.36%，差异有统计学意义(P＜0.05)。从抗原应答显示的斑点数来看，治疗前ESAT-6的平均值为18.47，治疗后下降至16.29，差异无统计学意义(P＞0.05)；而CFP-10治疗前平均斑点数为22.83，治疗后下降至15.31，差异有统计学意义(P＜0.05)。因考虑到斑点计数较为主观，斑点结果无法准确再现，研究中将斑点变化在5以内划分为“不变”，使用此方法，我们发现，67.26%的患者在治疗后CFP-10斑点数下降，而51.3%的患者在治疗后斑点数仍不变甚至上升(P＜0.05)。这些数据表明，结核治疗使CFP-10抗原应答有显著的下降和转化，但对ESAT-6抗原却无此效应。

目前已发表的关于结核治疗对T细胞对结核分支杆菌特异性抗原应答影响的纵向研究不多，研究对象也较少。Nicol等[7]研究团队的一项关于儿童的报道显示：T细胞对于ESAT-6的应答早期升高，在3个月后下降。一项由Aiken等[8]完成的89例患者研究中显示：ESAT-6和CFP-10的计数在治疗12个月后下降。Ewer等[9]报道：在接受3个月的异烟肼和利福平治疗后，38例患者在6个月后对ESAT-6和CFP-10的应答增加。这些学者所持的观点与我们的研究不尽相同，可能与研究对象数量和治疗时间长短等因素有关。且我们的研究存在一定的局限性：患者服药是自主执行，因此服药的依从性无法完全保证；此外，我们对于未经治疗的患者也无法跟踪作T细胞应答监测。但有来源于其他调查的数据显示：在无任何治疗干预的情况下，阳性T-SPOT.TB应答仍保持不变[9]。

T-SPOT.TB这项新兴的外周血检测试验有望最终取代沿用百年的结核菌素试验(TST)[10-11]，目前国内外已有许多关于该检测方法的报道，肯定了其在结核病诊断中的价值，在英美等发达国家，IGRAs已被列入了结核病的诊断指南，其主要用于辅助筛查儿童中的无症状感染者，HIV感染者合并结核感染的诊断以及结核潜伏感染的流行病学调查[12-13]。本研究则从治疗监测的角度，探讨了它在反映结核治疗中的应用价值，结果表明，该试验的两种抗原中CFP-10的数量变化是结核治疗更好的一项监测手段。更多关于此试验在结核治疗过程中的作用研究还在持续进行，一项结核病治愈的替代标志物或疾病进展的风险因素有望产生。

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Value of T-SPOT.TB assay on monitoring the tuberculosis treatment efficacy.

HE Zi-qi,LI Cong-rong.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the value of T-SPOT.TB assay on monitoring the tuberculosis treatment efficacy.MethodsWe used the T-SPOT.TB assay to measure T-cell interferon-γ responses to Mycobacterium tuberculosis-specific peptides early secretory antigenic target 6-kD protein(ESAT-6)and culture filtrate protein 10 (CFP-10)in 113 patients with tuberculosis before and after the treatment.The results of changes in T-SPOT.TB before and after the treatment were analyzed according to the combined and separate responses to ESAT-6 and CFP-10 antigens.ResultsWhen the treatment was completed,42(37.2%)of 113 patients with tuberculosis reverted to negative according to the T-SPOT.TB results,of which CFP-10 reversion rate was 48.9%(P＜0.001),and the ESAT-6 reversion rate was 20.0%(P=0.238).The mean number of spot-forming cells(SFCs)/2.5×105peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)pre-and post-treatment were respectively 18.47 versus 16.29 for ESAT-6(P=0.16)and 22.83 versus 15.31 for CFP-10(P＜0.01).ConclusionTuberculosis treatment has a differential effect on T-cell responses to ESAT-6 and CFP-10 as measured by T-SPOT.TB.The quantitative response to CFP-10 may be a more useful monitoring tool for treatment efficacy.

T-SPOT.TB assay;Early secretory antigenic target 6-kD protein(ESAT-6);Culture filtrate protein 10(CFP-10);Tuberculosis treatment

R52

A

1003—6350（2016）12—1923—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.12.009

2015-12-28)

李从荣。E-mail：congrongli33@hotmail.com