小檗碱在溃疡性结肠炎中作用及机制的研究进展

张　苏　王志斌　王　跃　仝令畅　王荣美　李　玲　张立超



小檗碱在溃疡性结肠炎中作用及机制的研究进展

张苏王志斌王跃仝令畅王荣美李玲张立超

200071上海市中医医院药剂科(张苏，王跃，张立超；张苏现为宁夏医科大学药学院硕士研究生)；200433上海，第二军医大学药学院药理教研室(王志斌，仝令畅，王荣美，李玲)

摘要：溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性肠道炎性疾病，其发病机制可能与遗传、环境、免疫及微生物有关。小檗碱是黄连的主要成分，临床上主要用于抗炎。近年来研究发现小檗碱对UC有良好的疗效，但治疗机制尚不完全清楚，可能通过调整肠道菌群结构、保护肠道屏障功能、调节免疫应答反应、影响氧化应激等来发挥治疗作用，该文就此作一综述，为小檗碱应用于UC治疗提供理论依据。

关键词：溃疡性结肠炎；小檗碱；紧密连接；免疫调节；氧化应激

溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性肠道炎性疾病，其病程漫长，常反复发作、迁延不愈，且长期的UC易发生癌变。近年来UC的发病率呈上升趋势，且趋于年轻化，以20～25岁患者居多。目前认为UC的发病可能与遗传、环境、免疫和微生物有关，但其确切机制并不清楚。临床上对UC的治疗以氨基水杨酸类药物、肾上腺糖皮质激素类药物及免疫抑制剂为主，但都存在一定的不良反应，如胃肠道不适、过敏反应等。

小檗碱又称黄连素，是从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取出的一种异喹啉类生物碱，具有抗炎、抗菌等药理作用。许多临床研究和动物实验研究证实，小檗碱对UC有良好的疗效，其可能通过调整肠道菌群结构、保护肠道屏障功能、调节免疫应答反应、影响氧化应激等来发挥作用。本文就小檗碱治疗UC的上述4个方面的作用机制作一综述。

1调整肠道菌群

小檗碱的生物利用度较低，经肠壁吸收差，使得其在被肠上皮细胞吸收之前可以在肠道中发挥药理作用。双歧杆菌具有保护肠黏膜、改善肠壁通透性的作用。用小檗碱(10 mg/kg和20 mg/kg)治疗三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎小鼠后，用BL琼脂板培养小鼠的新鲜粪便，发现小檗碱治疗组的双歧杆菌数量较对照组显著增加(P<0.05)，症状得到改善，且具有剂量依赖性，这表明小檗碱可通过恢复双歧杆菌的数量来保护肠道屏障[1]。

此外，小檗碱可通过影响肠道菌群的组成结构来调节结肠炎。双歧杆菌、产乙酸细菌(Blautia属)、支原体(Allobaculum属)等可产生短链脂肪酸(SCFA)，结肠黏膜能量来源的60%～70%为SCFA(主要为乙酸和丁酸)，肝脏能量的主要来源为脂肪酸氧化，而SCFA可不需载体直接进入线粒体，参与氧化供能。给予TNBS诱导的Wistar大鼠小檗碱(100 mg/kg)口服，连续给药18周后，发现小檗碱可显著升高粪便中的SCFA浓度，特别是乙酸和丙酸，这表明口服小檗碱能选择性地富集产SCFA的菌群，促进结肠内发酵，增加肠道中SCFA的产量，从而保护肠道屏障[2]。

2保护肠道屏障功能

2.1保护紧密连接

UC是一种肠黏膜炎性疾病，其发病和黏膜修复都与肠道屏障功能紧密相关。紧密连接(TJ)是构成肠上皮机械屏障功能最主要的结构，TJ的开放主要依赖于TJ蛋白的表达和分布，如咬合蛋白(occludin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)和闭合蛋白(claudin)等[3-4]。UC患者伴有TJ蛋白分布的改变。C57BL/6小鼠饮用含3% 葡聚糖硫酸钠(DSS)的水4 d，给予小檗碱(100 mg/kg)灌胃处理3 d，取结肠组织免疫染色后发现，小檗碱阻止了DSS诱导的ZO-1从TJ复合体顶端向结肠上皮细胞的细胞质隔室的重分布[5]。

酪氨酸激酶Src(Tyr416)信号通路影响claudin-1的表达及其在TJ中的分布，蛋白激酶B(PKB/Akt)主要影响claudin-2的表达。claudin-1增多可降低大分子的细胞通透性，claudin-2则可诱导Na+、K+等阳离子和水的细胞通道开放[6]。用50 μmol/L小檗碱预处理HT-29/B6细胞10 min，再加入肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(500 U/mL)孵育15 min，免疫印迹结果显示小檗碱可抑制TNF-α诱导的Akt(Ser473)、Akt(Thr308)及Src(Tyr416)磷酸化作用，并可下调claudin-2蛋白表达而上调claudin-1蛋白表达；激光共聚焦显微镜下可见，小檗碱可以逆转TNF-α引起的claudin-1蛋白脱离TJ向顶端细胞质的重分布，表明小檗碱通过抑制Src、Akt磷酸化，调节claudin-1的表达和重分布及claudin-2的表达，从而发挥肠道屏障保护作用[7]。

2.2调节血小板聚集

血小板不仅具有止血和血栓形成的作用，还可以通过释放炎性介质，扩大炎性反应。有研究发现，UC患者静脉血中血栓素B2(TXB2)水平高于正常组，说明UC患者伴有血小板活化和高凝血状态[8]。给予BALB/c小鼠饮用8% DSS以诱导UC模型，给予小檗碱(40 mg/kg和80 mg/kg)灌胃，结果显示灌胃后第3天和第7天的血浆TXB2和P-选择素水平均有显著降低(P<0.01)，这表明小檗碱呈时间、剂量依赖性降低血浆TXB2和P-选择素水平，从而改善DSS诱导的结肠炎小鼠血液的高凝状态，减少血小板凝集[5,9]。

3调节免疫应答反应

3.1调节促炎细胞因子

小肠是分泌内源性TNF的主要器官。TNF-α是UC结肠损伤中细胞因子连锁反应的关键性介质[10]。用50 μmol/L小檗碱预处理HT-29/B6细胞10 min后，用500 U/mL TNF-α孵化HT-29/B6细胞30 min，可减弱TNF-α诱导的Akt-P(Ser473)和Akt-P(Thr308)的磷酸化，表明小檗碱通过抑制PI3K/Akt信号通路中Akt的磷酸化作用而减弱TNF-α对肠道的损伤[7]。

干扰素-γ(IFN-γ)和TNF-α等细胞因子可通过影响TJ的结构和功能来破坏肠道屏障功能[11]。透射电镜下可见，小檗碱(100 μmol/L)对IFN-γ(100 U/mL)和TNF-α(10 ng/mL)处理Caco-2细胞后导致的细胞间TJ结构不完整、出现部分断裂有明显抑制作用；Transwell实验结果显示，经小檗碱处理后，异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FD-4)的流出速率较对照组显著降低，表明小檗碱能抑制促炎细胞因子造成的TJ破坏，从而降低肠上皮细胞的通透性[12-15]。

免疫系统功能紊乱及各类免疫细胞表达失衡在UC发生发展中起重要的作用。有研究发现CD4+T亚型Th1/Th17细胞分化调节控制的炎性细胞因子IFN-γ、白细胞介素-17(IL-17)表达失衡在UC的发病中起作用。有研究用2.5% TNBS诱导BALB/c小鼠，给予小檗碱(100 mg/kg)治疗，可降低结肠组织中IFN-γ和IL-17的水平，流式细胞术发现小檗碱可降低脾脏中Th1细胞(分泌IFN-γ)、Th17细胞(分泌IL-17)的细胞比例及CD4+CD25+Foxp3+T细胞(Treg细胞)的数量，表明小檗碱可通过下调Th1和Th17细胞亚群比例及抑制Treg细胞的分化，进而降低炎性因子的水平，缓解肠道炎性反应；此外，小檗碱可下调脾脏纯化得到的CD4+T细胞中信号转导与转录激活因子1(STAT1)、STAT3的磷酸化，STAT信号通路是Th1、Th17细胞分化的重要通路，表明小檗碱通过抑制STAT1、STAT3的磷酸化，进而抑制Th1、Th17细胞的分化，从而控制炎性反应[16]。

3.2调节转录因子

核因子-κB(NF-κB)的信号级联放大在炎性反应应答中具有重要作用，其能促进促炎因子、趋化因子、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶(COX-2)、黏附分子和炎性反应受体的表达。用50 μmol/L小檗碱预孵化HT-29/B6细胞10 min，可抑制TNF-α诱导的NF-κB和IκBα磷酸化，其减弱TNF-α的效应类似于NF-κB的特异性抑制剂BAY11-7082(10 μmol/L)[ 17]。用50 μmol/L小檗碱孵育Jurkat细胞18 h，再用0.1 nmol/L TNF-α孵育10 min，发现小檗碱可以抑制NF-κB p65的磷酸化、核移位及IκBα降解，并可完全抑制IκB激酶(IKK)的激活[18]。50 μmol/L小檗碱孵育Jurkat细胞18 h，再用50 μg/mL蛋白酶体抑制剂ALLN孵育30 min，最后用0.1 nmol/L TNF-α处理10 min，免疫印迹分析胞质提取物发现小檗碱可以明显抑制IκBα磷酸化。这些结果表明小檗碱的抗炎作用通过NF-κB信号通路抑制IKK的激活，导致IKK稳定化，进而抑制IκBα的降解，还可通过抑制NF-κB和IκBα的磷酸化从而抑制NF-κB活化[17-18]。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者，其可分为4个亚族：细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、p38、C-Jun氨基末端激酶(JNK)/应激激活蛋白激酶(SAPK)和ERK5。UC患者体内MAPK的激活增加，内毒素(LPS)刺激的腹腔巨噬细胞中MAPK的激活也增加。C57BL/6小鼠饮用含3% DSS的水4 d后，用小檗碱(100 mg/kg)灌胃处理3 d，免疫印迹结果显示小檗碱可抑制由DSS引起的结肠上皮细胞的ERK1/2、p38、JNK的磷酸化，表明小檗碱通过抑制ERK1/2、p38、JNK的磷酸化从而抑制MAPK的激活，进而阻断信号传递[5,19]。

3.3调节中性粒细胞

TNF-α能够刺激血管内皮细胞及中性粒细胞(PMN)表达表面黏附分子，促进PMN聚集，利于PMN释放活性氧(ROS)和蛋白水解酶等，从而加重结肠的损伤程度。用30 g/L DSS诱导Wistar大鼠7 d，再给予小檗碱(50 mg/kg)3 d，免疫组织化学结果显示小檗碱可下调DSS引起的结肠组织细胞间黏附分子(ICAM-1)的表达，并可减少结肠组织中PMN的表达，说明小檗碱通过抑制PMN与内皮细胞黏附分子的表达，进而减少炎性细胞浸润，减轻炎性反应[20-21]。

髓过氧化物酶(MPO)主要由PMN、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌，外界刺激可导致PMN聚集并释放MPO。C57BL/6小鼠饮用含3% DSS的水4 d后，用小檗碱(100 mg/kg)灌胃处理3 d，与对照组相比较，发现小檗碱可显著抑制DSS诱导的MPO活性及含量增加，表明小檗碱通过抑制MPO的活性来改善UC的症状[5,20,22]。

3.4调节内质网应激

内质网(ER)是哺乳动物细胞中一种重要的亚细胞器，具有蛋白质修饰、加工以及新生肽链的折叠、组装和运输的重任。机体内外环境改变，均可造成未折叠或错误折叠蛋白质在ER内蓄积，引发内质网应激(ERS)。持续而严重的ERS，可触发ER相关性细胞凋亡，造成细胞损伤。X-盒结合蛋白1(XBP1)是ERS过程中重要的信号通路，敲除小鼠肠上皮细胞中的XBP1基因可引起肠道发生自发性炎性反应，其组织学改变与人类UC相似，说明ERS在UC的发生发展中起着重要的作用[17]。

GRP78又称免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)，是一种ER分子伴侣蛋白，在维持ER蛋白质合成、正确折叠和细胞钙稳态等方面起着重要的作用。ERS时GRP78的表达上调。持续的ERS启动天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(caspase-12)的凋亡途径，造成细胞损伤。caspase-12活化后可以诱导caspase-3表达升高，共同诱导细胞凋亡。用20 μmol/L小檗碱预处理Caco-2细胞2 h，再用2.5 ng/mL IFN-γ和50 ng/mL TNF-α孵育24 h，结果显示小檗碱可显著降低GRP78的表达，降低剪切形式的XBP1 mRNA水平以及抑制caspase-3升高，这表明小檗碱能抑制ERS，达到减轻肠道炎性反应和保护肠道的作用[23]。

4影响氧化应激

体内的高活性分子如ROS和活性氮(RNS)产生过多，引起氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤[24]。UC患者体内ROS和一氧化氮(NO)明显增多，引起体内氧化、结肠组织和细胞损伤，形成周而复始的连锁反应[25]。用30 g/L DSS诱导Wistar大鼠7 d，再给予50 mg/kg小檗碱3 d，免疫组织化学结果显示小檗碱可抑制结肠组织iNOS的表达；此外小檗碱可显著增加血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，并可明显抑制丙二醛(MDA)、NO水平，这表明小檗碱可通过增强抗氧化系统、抑制氧化系统来调节肠道内的氧化应激，减轻黏膜损伤[26-27]。

5结语

UC是目前胃肠道难治性疾病之一，易反复发作，小檗碱主要通过调整肠道菌群结构、保护肠道屏障功能、调节免疫应答反应及影响氧化应激等发挥治疗UC的作用。然而，现有研究仍不能完全解释小檗碱治疗UC的具体机制，需要更多动物或临床研究结果揭示其作用机制，为小檗碱应用于UC提供理论依据。

参考文献

1 Lee IA, Hyun YJ, Kim DH. Berberine ameliorates TNBS-induced colitis by inhibiting lipid peroxidation, enterobacterial growth and NF-κB activation[J]. Eur J Pharmacol, 2010, 648: 162-170.

2 Zhang X, Zhao Y, Zhang M, et al. Structural changes of gut mierobiota during berberine-mediated prevention of obesity and insulin resistance in high-fat diet-fed rats[J]. PLoS One, 2012, 7: e42529.

3 Zahraoui A, Louvard D, Galli T. Tight Junction, a platform for trafficking and signaling protein complexes[J]. J Cell Biol, 2000, 151: F31-F36.

4 Valenzano MC, DiGuilio K, Mercado J, et al. Remodeling of tight junctions and enhancement of barrier integrity of the Caco-2 intestinal epithelial cell layer by micronutrients[J]. PLoS One, 2015, 10: e0133926.

5 Yan F, Wang L, Shi Y, et al. Berberine promotes recovery of colitis and inhibits inflammatory responses in colonic macrophages and epithelial cells in DSS-treated mice[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012, 302: G504-G514.

6 Amasheh S, Meiri N, Gitter AH, et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells[J]. J Cell Sci, 2002, 115: 4969-4976.

7 Amasheh M, Fromm A, Krug SM, et al. TNFalpha-induced and berberine-antagonized tight junction barrier impairment via tyrosine kinase, Akt and NFkappaB signaling[J]. J Cell Sci, 2010, 123: 4145-4155.

8 Liu Y, Wang XY, Yang X, et al. Lung and Intestine: a specific link in an ulcerative colitis rat model[J]. Gastroenterol Res Pract, 2013, 2013: 124530.

9 Hong T, Yang Z, Lv CF, et al. Suppressive effect of berberine on experimental dextran sulfate sodium-induced colitis[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol, 2012, 34: 391-397.

10 Mankertz J, Amasheh M, Krug SM, et al. TNF-α up-regulates claudin-2 expression in epithelial HT-29/B6 cells via phosphatidylinositol-3-kinase signaling[J]. Cell Tissue Res, 2009, 336: 67-77.

11 Singh UP, Singh NP, Murphy EA, et al. Chemokine and cytokine levels in inflammatory bowel disease patient[J]. Cytokine, 2016, 77: 44-49.

12 Li N, Gu L, Qu L, et al. Berberine attenuates pro-inflammatory cytokine-induced tight junction disruption in an in vitro model of intestinal epithelial cells[J]. Eur J Pharm Sci, 2010, 40: 1-8.

13 Gu L, Li N, Li Q, et al. The effect of berberine in vitro on tight junctions in human Caco-2 intestinal epithelial cells[J]. Fitoterapia, 2009, 80: 241-248.

14 Cao M, Wang P, Sun C, et al. Amelioration of IFN-γ and TNF-α-induced intestinal epithelial barrier dysfunction by berberine via suppression of MLCK-MLC phosphorylation signaling pathway[J]. PLoS One, 2013, 8: e61944.

15 Wang Y, Yi X, Ghanam K, et al. Berberine decreases cholesterol levels in rats through multiple mechanisms, including inhibition of cholesterol absorption[J]. Metabolism, 2014, 63: 1167-1177.

16 Li C, Xi Y, Li S, et al. Berberine ameliorates TNBS induced colitis by inhibiting inflammatory responses and Th1/Th17 differentiation[J]. Mol Immunol, 2015, 67: 444-454.

17 Hao X, Yao A, Gong J, et al. Berberine ameliorates pro-inflammatory cytokine-induced endoplasmic reticulum stress in human intestinal epithelial cells in vitro[J]. Inflammation, 2012, 35: 841-849.

18 Pandey MK, Sung B, Kunnumakkara AB, et al. Berberine modifies cysteine 179 of IkappaBalpha kinase,suppresses nuclear factor-kappaB-regulated antiapoptotic gene products,and potentiates apoptosis[J]. Cancer Res, 2008, 68: 5370-5379.

19 Jeong HW, Hsu KC, Lee JW, et al. Berberine suppresses proinflammatory responses through AMPK activation in macrophages[J]. Am J Physiol Endocrinal Metab, 2009, 296: E955-E964.

20 Li HM, Wang YY, Wang HD, et al. Berberine protects against lipopolysaccharide-induced intestinal injury in mice via alpla 2 adrenoceptor-independent mechanisms[J]. Acta Pharmacol Sin, 2011, 32: 1364-1372.

21 Amasheh M, Grotjohann I, Amasheh S, et al. Regulation of mucosal structure and barrier function in rat colon exposed to tumor necrosis factor alpha and interferon gamma in vitro: a novel model for studying the pathomechanisms of inflammatory bowel disease cytokine[J]. Scand J Gastroenterol, 2009, 44: 1226-1235.

22 Zhou H, Mineshita S. The effect of berberine chloride on experimental colitis in rats in vivo and in vitro[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2000, 294: 822-829.

23 Kaser A, Lee AH, Franke A, et al. XBP1 links ER stress tointestinal inflammation and confers genetic risk for human inflammatory bowel disease[J]. Cell, 2008, 134: 743-756.

24 Gu M, Xu J, Han C, et al. Effects of berberine on cell cycle, DNA, reactive oxygen species, and apoptosis in L929 murine fibroblast cells[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2015, 2015: 796306.

25 Zhu H, Li YR. Oxidative stress and redox signaling mechanisms of inflammatory bowel disease: updated experimental and clinical evidence[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2012, 237: 474-480.

26 Zhang Q, Piao XL, Piao XS, et al. Preventive effect of Coptis chinensis and berberine on intestinal injury in rats challenged with 1ipopolysaccharides[J]. Food Chem Toxicol, 2011, 49: 61-69.

27 Kuo CL, Chi CW, Liu TY. The anti-inflammatory potential of berberine in vitro and in vivo[J]. Cancer Lett, 2004, 203: 127-137.

(本文编辑：林磊)

基金项目：国家自然科学基金(81273504，81473258，81402941)

通信作者：张立超，Email: changhaiskin@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.03.002

(收稿日期：2015-11-25)