MF59佐剂的研究进展

李卓凡 综述，李卫东 审校

(中国医学科学院/北京协和医学院/医学生物学研究所，昆明 650118)



·综述·

MF59佐剂的研究进展

李卓凡 综述，李卫东△审校

(中国医学科学院/北京协和医学院/医学生物学研究所，昆明 650118)

MF59；佐剂；作用机制

MF59佐剂的研究始于20世纪80年代末期。在当时重组DNA背景下，许多新的蛋白质抗原都可以用于疫苗制备。Chiron疫苗公司研制的HBV重组疫苗的成功尤其推动了这种微生物加铝佐剂的疫苗模式[1]。但HBV是1种特殊的，可以自发形成高免疫原性病毒样颗粒的抗原，而其他大多数重组抗原均是可溶解的单体，并且在和铝佐剂结合后只有很弱的免疫原性。这些抗原需要比铝佐剂效力更强的佐剂来获得保护性的免疫力，如弗氏佐剂。因此，研制1种既能提高抗原的免疫原性，又可以避免像弗氏佐剂一样的反应原性佐剂就成了问题的关键。而20多年后，MF59成为第2个成功上市的佐剂，说明了这一工作的成功。

1　MF59

1.1乳剂作为佐剂将乳剂用于佐剂已有很长的历史。Freund等[2]在70多年前证明了矿物油(石蜡)与结核分枝杆菌结合具有佐剂的作用，即弗氏完全佐剂。而之后油包水(w/o)不含细菌成分的乳剂(弗氏不完全佐剂)被用于兽用疫苗。尽管弗氏不完全佐剂也曾被用于人用疫苗(如流感疫苗)，但其反应原性限制了广泛的使用。乳佐剂的早期应用为MF59的研制提供了一定的思路，即油相需要生物可降解，表面活性剂需具有可安全应用的历史背景。水包油(o/w)乳剂可将油相比例降低，从而显著增加人体对佐剂的耐受性，同时也可降低佐剂的黏度。因此，在20世纪80年代末，o/w乳剂作为佐剂开始被应用于免疫增强剂[3-4]。

1.2表面活性剂药物乳剂是1种内部不稳定的分散体，需要加入表面活性剂降低界面张力，防止液滴凝结。表面活性剂通常含有疏水性和亲水性2种组分，定位于界面上。尽管带电的表面活性剂是乳剂稳定剂的最佳选择，但非离子性表面活性剂因其低毒性和对添加剂的低敏感性而更广泛地使用。表面活性剂根据其亲水性与疏水性的比例(HLB、1～20)，可以定义其相对的水相或油相的亲和力。聚山梨醇酯(Tween)是HLB在9～16的表面活性剂，而失水山梨醇酯(Span)HLB为2～9。HLB值高与低的表面活性剂的组合是常用的乳剂稳定剂。因此，表面活性剂的选择是MF59研制的重要步骤，使其成为微小的、稳定的液滴，能够被过滤除菌[5]。

1.3角鲨烯MF59中的油相组分是角鲨烯，是1种自然生成的三萜烯烃，组分单一(C30H50)但结构复杂，在许多植物、动物以及人体中都有分布。角鲨烯是生物合成人体甾类激素途径的中间物，是合成胆固醇的前体物质。角鲨烯在人体肝脏中合成(>1 g/d)并通过血流循环，在皮肤分布最多，是皮脂分泌物的主要组分。同时，在脂肪组织、肌肉和淋巴结中，大量的角鲨烯在自然情况下均有分布。因此，角鲨烯是兼具生物可降解性和生物兼容性的组分，也是人类饮食的1种正常组分，人类正常摄入50～200 mg/d。

1.4MF59的生产MF59基本生产步骤是将Span85分散在含有角鲨烯和Tween80的缓冲液中，之后高速搅拌至乳状。之后，将乳剂反复用微射流机流射以形成o/w乳剂的微粒(160 nm)，再过滤除菌。MF59乳剂制备后可保持稳定性达3年以上。

2　MF59的作用机制

2.1MF59不在注射部位形成抗原库早期用于疫苗生产的乳佐剂是w/o的形式，通常包含不可降解的油脂，可在注射部位有效地形成1个抗原库[6]。在针对MF59的机制研究中，研究者用放射性物质(I125Ag、H3squalene)标志抗原(gD2)和角鲨烯，观察了其在兔的肌肉注射部位的运输情况。这些研究显示，被标志的角鲨烯中只有10%在注射6 h后仍在注射的点上，并在120 h后降低至5%。同时，尽管在6 h后有25%的gD2抗原仍在注射点，120 h后降低至0.05%。因此，说明MF59不同于w/o形式的佐剂，并未在注射部位形成抗原库。抗原和佐剂以不同的动力学速率被相对快速地清除[7]。

2.2MF59激发注射部位的抗原提呈上升早期有研究应用免疫荧光共聚焦的方法评估了小鼠中佐剂和抗原在注射部位附近组织的分布情况(DiI squalene、FITC gD2)[8]。肌肉注射3 h后，MF59大部分在细胞外，少量可在引流淋巴结的膜下检测到，说明存在一定程度的胞外运输，可能直接通过淋巴管进行。注射后48 h，MF59和抗原gD2大部分出现在注射部位的细胞内。与此同时，48 h时在引流淋巴结内也出现了MF59数量增多的情况。在T细胞附近的副皮质区域也发现了含有MF59的细胞。MF59很可能是在细胞内被运输至淋巴结，这是MF59作用机制中最重要的1个途径。肌肉注射后，MF59和抗原在细胞内的共定位观察到MF59可以起到运输系统的作用，激活附近的细胞对抗原进行提呈。注射部位含有抗原的细胞对DEC205和MHCⅡ型细胞呈阳性反应，证明这些细胞是前树突状细胞。关于MF59是运输系统的假设在对分离出的人的免疫细胞进行细胞内研究时得到了证明。研究说明，MF59可以直接增强吞噬作用和胞饮作用并促进抗原提呈细胞对抗原的提呈作用。并且据推测，MF59能够作用的主要细胞类型是单核细胞，可以被募集至佐剂作用的部位，吸收抗原并参与佐剂引起的针对树突状细胞表型的分化[9]。

2.3MF59召集免疫细胞到注射部位MF59注射后，通过对肌肉细胞的分离，密度梯度纯化及流式细胞分析，显示出其对于单核细胞的召集作用[10]。MF59注射后2 d，分离出的肌肉部位的单核细胞增加了7倍，之后缓慢减少。这些细胞中很大一部分是F4/80阳性的巨噬细胞，少部分是CD11c阳性的树突状细胞。目前的猜测是MF59的注射促进了趋化因子的分泌，从而召集了外周血中的单核细胞。1项研究显示，CCR2 阳性小鼠中的细胞流动与CCR2-/-(无主要趋化因子受体)敲除的小鼠有显著区别。CCR2是单核细胞趋化蛋白1～5受体(MCP-1～MCP-5)，表达于单核细胞上。因此，在CCR2 敲除的小鼠上检测到细胞流动的增加是MF59对于细胞召集的有力说明。这项假说被另1个将MF59用作佐剂的团队进一步印证。Hui等[11]的试验显示了缺乏ICAM-1分子的小鼠对镰状虐原虫疫苗的中和抗体滴度远低于正常对照组小鼠。ICAM-1在细胞黏附及血细胞外渗中起重要作用，因此这是细胞渗透的重要中介。ICAM-1依赖的免疫反应是MF59类似的乳佐剂特异性的，未在MPL类似的免疫增强佐剂中发现。

2.4MF59募集中性粒细胞和单核细胞进行抗原提呈并运输至引流淋巴结Calabro和同事将荧光标志的佐剂和模式抗原卵清蛋白(OVA)注射至小鼠体内并用流式细胞法分析肌肉和淋巴结细胞。他们检测到不同类型的免疫细胞在肌肉细胞中的重复波动，包括粒细胞和嗜酸性细胞等，及潜在的抗原提呈细胞，如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。这些细胞会在2～3周内将佐剂和抗原一同运输至引流淋巴结[12]。

2.5MF59促进抗原在淋巴结和滤泡树突状细胞的停留有报道，在研究MF59对疫苗抗原的促进作用时，用免疫荧光共聚焦的方法研究了抗原向小鼠淋巴结的运输情况。他们在小鼠免疫后1、6 h和7 d时取引流淋巴结观测。1 h 后，抗原就可在淋巴结的被膜下窦和髓室被检测到，至二免后，抗原全部保存在滤泡树突状细胞。同时，也检测到生发中心B淋巴细胞对抗原特异性抗体的大量分泌，而不加MF59的组别并无此现象，这说明MF59 对于抗原在淋巴节中保存并提呈起到了直接作用[13]。

3　MF59与流感疫苗的结合

从1990年开始，许多公司致力于研究新型的疫苗佐剂，类型包括乳佐剂、免疫刺激复合物、脂质体和微粒[14]。Syntex公司研制的o/w 乳佐剂包含角鲨烯和1种化学合成的免疫增强剂，N-乙酰胞壁酸-L-苏氨酸-D谷氨酰胺。N-乙酰胞壁酸-L-苏氨酸-D谷氨酰胺是MDP的衍生物，是分枝杆菌细胞壁中最有效的佐剂成分。但该佐剂的反应原性太强被放弃。之后Chiron 疫苗公司用角鲨烯和1种化学合成的MDP(胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺，MDP-PE)做流感疫苗佐剂(MF59)，也因反应原性被放弃。但根据其临床前及临床研究，MDP-PE并不是MF59 作为流感疫苗佐剂所必须的成分[15-16]。因此，MF59的成分确定为角鲨烯1种组分，并只针对1种目标人群是老年人的流感疫苗。

自MF59 1997年批准上市，大量的临床研究和上市后的监控研究均证明了MF59的安全性和可靠性，在应对2009年H1N1流感大流行时，也证明了其广泛使用时的可靠性。最近，在连续3个流感流行季节展开的大规模(>170 000 例)具有前瞻性的观察项目后，添加MF59 佐剂的流感疫苗将65岁以上因为流感和肺炎而入院的老人的数量降低了23%[17]。

但目前在美国，有许多伊拉克退伍士兵在退伍之后患有“海湾战争综合征”的情况被与其曾接种含有角鲨烯的流感疫苗的经历联系起来，引起了一些质疑。而关于佐剂中的角鲨烯是否能够引起角鲨烯特异性的抗体，目前还存在争议[18]。

4　MF59和其他疫苗的研究进展

除了在流感疫苗上的成功使用，MF59在其他疫苗的临床前研究中也表现出了免疫增强的作用。许多临床研究的疫苗都已经有加入MF59 佐剂之后的评价研究，如HIV、CMV、HSV、HBV、HCV等。

MF59在单纯疱疹病毒疫苗(HSV-2)的3期保护效力试验被评价为无法提供持续的保护效力。在之前的研究中，HSV-2同样没有显示出治疗性疫苗的保护效力，但错误的要求交叉保护性才是失败的关键[19]。1个加入MF59佐剂的疫苗进入临床研究的原因是其能够引起高滴度的中和抗体和效应T细胞的反应。如果能够以这种简单的标准来评价疫苗，就能够达到疫苗研制的初衷[20]。但高滴度的中和抗体无法提供对HSV-2感染的保护，且性传播疾病通常暴露在高病毒载量环境下。

5　结　　语

MF59能够成为继铝佐剂之后第2个成功上市的佐剂，与研发者独特的眼光密不可分，也有从之前的佐剂研发失败的经历中获得的宝贵经验，也有一定的运气成分——与已上市的流感疫苗的联系促成了这一成就。研究者们在尝试将更多的疫苗与MF59佐剂结合起来，但这一路途必然艰巨而不可知。无论如何，MF59 佐剂在其安全性方面从未失败过，在其评价的试验中均表现出良好的耐受性。在今后的发展中，MF59 将继续被其他疫苗所利用，例如CMV，也会在HIV疫苗的效力试验中作为单独的免疫增强剂[21]。近期，MF59也将应用于流感四价疫苗中。

[1]Valenzuela P,Medina A,Rutter WJ,et al.Synthesis and assembly of hepatitis B virus surface antigen particles in yeast[J].Nature,1982,298(5872):347-350.

[2]Freund J,Casals J,Hosmer EP.Sensitization and antibody formation after injection of tubercle bacilli and paraffin oil[J].Experimental Biology&Medicine,1937,37(3):509-513.

[3]Masihi KN,Lange W,Brehmer W,et al.Immunobiological activities of nontoxic lipid A:enhancement of nonspecific resistance in combination with trehalose dimycolate against viral infection and adjuvant effects[J].Int J Immunopharmacol,1986,8(3):339-345.

[4]Allison AC,Byars NE.An adjuvant formulation that selectively elicits the formation of antibodies of protective isotypes and of cell-mediated immunity[J].J Immunol Methods,1986,95(2):157-168.

[5]Ott G,Barchfeld GL,Chernoff D,et al.MF59 Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines[M]//Vaccine Design.Springer US,1995:277-296.

[6]Freund J.The mode of action of immunologic adjuvants[J].Bibl Tuberc,1956,7(10):130-148.

[7]Dupuis M,Mcdonald DM,Ott G.Distribution of adjuvant MF59 and antigen gD2 after intramuscular injection in mice[J].Vaccine,1999,18(5/6):434-439.

[8]Dupuis M,Murphy TJ,Higgins D,et al.Dendritic cells internalize vaccine adjuvant after intramuscular injection[J].Cell Immunol,1998,186(1):18-27.

[9]Monaci E,Mancini F,Lofano G,et al.MF59-and Al(OH)3-Adjuvanted staphylococcus aureus (4C-Staph) vaccines induce sustained protective humoral and cellular immune responses,with a critical role for effector CD4 T cells at low antibody titers[J].Front Immunol,2015,6:439.

[10]Dupuis M,Denis-Mize K,Labarbara A,et al.Immunization with the adjuvant MF59 induces macrophage trafficking and apoptosis[J].Eur J Immunol,2001,31(10):2910-2918.

[11]Hui G,Hashimoto C.The requirement of CD80,CD86,and ICAM-1 on the ability of adjuvant formulations to potentiate antibody responses to a Plasmodium falciparum blood-stage vaccine[J].Vaccine,2007,25(51):8549-8556.

[12]Nouri A,Laraba-Djebari F.Enhancement of long-lasting immunoprotective effect against Androctonus australis Hector envenomation using safe antigens:Comparative role of MF59 and Alum adjuvants[J].Vaccine,2015,33(43):5756-5763.

[13]Cantisani R,Pezzicoli A,Cioncada R,et al.Vaccine adjuvant MF59 promotes retention of unprocessed antigen in lymph node macrophage compartments and follicular dendritic cells[J].J Immunol,2015,194(4):1717-1725.

[14]Vogel FR,Powell MF.A compendium of vaccine adjuvants and excipients[J].Pharm Biotechnol,1995,6(6):141-228.

[15]Keefer MC,Graham BS,McElrath MJ,et al.Safety and immonogenincity of Env 2-3,a human immunodeficiency virus type 1 candidate vaccine,in combination with a novel adjuvant,MTP-PE/MF59.NIAID AIDS Vaccine Evaluation Group.AIDS Res[J].Hum Retroviruses,1996,12(8):683-693.

[16]Kahn JO,Sinangil F,Baenziger J,et al.Clinical and immunologic responses to human immunodeficiency virus(HIV) type 1SF2 gp120 subunit vaccine combined with MF59 adjuvant with or without muramyl tripeptide dipalmitoyl phosphatidylethanolamine in non-HIV-infected human volunteers[J].J Infect Dis,1994,170(5):1288-1291.

[17]Mannino S,Villa M,Apolone G,et al.Effectiveness of adjuvanted influenza vaccination in elderly subjects in northern Italy[J].Am J Epidemiol,2012,176(6):527-533.

[18]Asa PB,Cao Y,Garry RF.Antibodies to squalene in gulf war syndrome[J].Exp Mol Pathol,2000,68(1):55-64.

[19]Stanberry LR.Clinical trials of prophylactic and therapeutic herpes simplex virus vaccines[J].Herpes,2004,11(Suppl 3):A161-169.

[20]Corey L,Langenberg AG,Ashley R,et al.Recombinant glycoprotein vaccine for the prevention of genital HSV-2 infection:two randomized controlled trials.Chiron HSV Vaccine Study Group[J].JAMA,1999,282(4):331-340.

[21]Fu TM,An Z,Wang D.Progress on pursuit of human cytomegalovirus vaccines for prevention of congenital infection and disease[J].Vaccine,2014,32(22):2525-2533.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.035

A

1673-4130(2016)18-2596-03

2016-02-23

2016-05-06)