胆汁淤积中多耐药相关蛋白作用

沈斐斐　陆伦根



胆汁淤积中多耐药相关蛋白作用

沈斐斐陆伦根

胆汁主要由肝细胞和胆管细胞分泌产生，其形成机制十分复杂。在整个机制中最为关键的步骤就是顶端或毛细胆管膜上将胆盐、有机物质等大量溶质排入毛细胆管形成原始胆汁流的过程。这一步骤主要由具有ATP结合域的盒式跨膜转运蛋白(ABC转运蛋白)介导，毛细胆管胆汁酸盐输出泵(BSEP)和多耐药相关蛋白(MRP2)均属于ABC转运蛋白家族，其中BSEP负责胆汁盐排出，通过水解ATP，跨膜转运结合胆汁酸盐，形成毛细胆管内胆汁酸依赖性胆汁流；MRP2负责介导其他有机阴离子(包括胆红素)进入胆汁，参与肝细胞的多种毒性复合物的转运，是非胆汁依赖性胆汁流形成的重要因素。在转运过程中，毛细胆管膜上胆汁酸盐和其他有机离子等大量溶质的排入使得毛细胆管内渗透压升高，从而形成胆汁流。基于胆汁流的形成机制，以及胆汁流中的主要溶质-胆汁酸盐具有高度的细胞毒性，肝细胞中胆汁的排出过程需要精细调节。但在(梗阻性)胆汁淤积情况下，上述过程调节的缺失会使胆汁盐积聚，继而引起肝细胞内压力增高、细胞裂解，从而导致了严重的肝脏损伤。

一、生理与胆汁淤积条件下MRP2的分布与定位

胆汁淤积是指肝细胞或胆管细胞水平上的胆汁生成障碍、胆汁分泌障碍和/或流动障碍导致胆汁无法正常流入十二指肠，从而反流进入血液循环中。其发生与多种因素相关，毛细胆管膜中转运蛋白活性的下降和基底外侧细胞膜中其他转运蛋白活性的增加是目前公认的引起胆汁淤积发生的机制之一。肝窦基底外侧膜和毛细胆管膜的这种改变有助于阻止毛细胆管内的渗透压过高、降低肝脏损伤的发生以及防止胆汁反流进入血液中。多耐药相关蛋白亚家族最初发现于1992年，目前已知的成员有9个，分别为MRP1-7、ABCC11-12[1]。MRP2是第二个被发现的亚家族成员，可定位于肝细胞的毛细胆管膜侧面、肾近端小管细胞管腔膜侧、小肠的黏膜上皮侧、以及胆囊上皮细胞等极性细胞的顶膜。主要负责转运其他有机阴离子(包括胆红素)进入胆汁，并参与肝细胞的多种毒性复合物的转运，保护机体和肝细胞避免毒性物质的损伤。MRP2介导很多阴离子的毛细胆管排泄，这些阴离子大都是二价的两性分子，且随着肝(实质)细胞Ⅱ相结合中产生的谷胱甘肽、葡萄糖醛酸和硫酸盐的变化而变化(如胆红素二葡萄糖苷酸)。GSH的毛细胆管排泄也由MRP2介导。带有两个负电荷的二价胆汁酸盐如牛磺酸盐和葡萄糖石胆酸盐是由MRP2介导的，然而MRP2却对一价胆汁酸盐无作用。不过，个别氨基酸的突变会使MRP2具有转运一价胆汁酸盐的能力。其他MRP的异构形式如MRP1和MRP3存在于基质膜，MRP2功能损坏发生胆汁淤积时，它们可起代偿作用。小鼠的MRP2基因位于染色体19D2上，19D2与胆石症易感性相关。人类MRP2基因位于染色体10q24上，MRP2基因突变会导致Dubin-Johnson综合征，这种综合征以内源性和外源性两性化合物的毛细胆管排泄障碍为特征。这种在大鼠模型及人类基因的突变可导致多种有机阴离子的排泄缺陷，包括二价胆汁酸、结合胆红素、粪卟啉异构体、白三烯及许多其他化合物，如BSP、吲哚青绿、口服胆囊造影剂、抗生素如氨苄青霉素和头孢曲松以及重金属。当Dubin-Johnson综合征中一些MRP2突变基因在HepG2细胞中表达时，突变产生的蛋白质不能够做为顶膜的靶向，而是潴留在内质网中，随后降解于蛋白体中。在健康人群的肝脏中，BSEP、MRP2以及多耐药糖蛋白I(MDRI)P-糖蛋白均定位在肝细胞毛细胆管膜上，但在患有胆汁淤积性疾病患者的肝脏中，大部分相关的转运蛋白均定位在顶端下囊泡中，因此阻断了大部分毛细胆管的分泌过程[2,3]。然而导致这种重定位发生的机制至今尚未完全明确。2002年研究发现在生理情况下，MRP2的定位依赖于其与根蛋白在细胞骨架中的交互作用[4]。随后，Kojima等[5,6]研究发现在患有胆汁淤积性疾病的患者及小鼠模型的肝脏中根蛋白和MRP2的共区域化作用受到干扰。

二、ERM蛋白与MRP2的作用

ERM蛋白家族成员埃兹蛋白(Ezrin)、根蛋白(radixin)以及膜突蛋白(moesin)属于同源蛋白，是连接质膜与细胞骨架的桥梁分子。可参与形成细胞表面特化结构，维持细胞正常形态，参与细胞生长、迁移的调控以及膜运输。大多数细胞中存在着不止一种ERM蛋白，根蛋白是肝细胞中主要的ERM蛋白。根蛋白和埃兹蛋白主要定位于上皮细胞顶侧膜，膜突蛋白主要定位于内皮细胞中。ERM蛋白可在其特定位点发挥锚定作用，特别是对转运蛋白的定位具有重要意义。目前已有研究表明，转运蛋白可与一个或者多个ERM蛋白家族成员在相应区域通过PDZ蛋白(突触后密度蛋白95(PSD-95)/果蝇discs large蛋白(Drosophila discs large)/胞质紧密粘连蛋白1(ZO-1))发生交互作用，然后使其准确的定位在特定膜域。生理情况下，MRP2锚定于肝细胞顶端毛细胆管膜上。在胆汁淤积情况下，MRP2也可以由胆管膜上撤回到顶端下囊泡中。渗透压过高、受到病理因素影响如：细胞因子、内毒素或应激等情况，均可导致MRP2从肝细胞胆管膜上撤回到顶端下囊泡内，从而使MRP2在肝细胞胆管膜上的表达减少。有研究表明Radixin-/-小鼠患有新生儿高胆红素血症与毛细胆管膜中MRP2的胆红素分泌泵的大量缺失相关[4]。另有多项研究表明[5-7]，在胆道梗阻、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、药物性肝损等多种原因引起的胆汁淤积条件下，均可发现存在根蛋白位置分布异常或表达下降，并推测MRP2在肝细胞毛细胆管膜锚定失败、撤回到顶端下囊泡内可能与此相关。由此我们可以推断，根蛋白是MRP2在毛细胆管膜中进行准确定位，和/或是维持MRP2在相应位点活性的重要蛋白。值得注意的是，在这样的定位体系中MRP2并不是唯一的ABC转运蛋白。囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)是一种重要的氯离子通道，也是ABC转运蛋白家族的成员之一，同样依赖于ERM蛋白在各类上皮细胞顶端细胞膜中进行锚定和定位。据此可以发现在患有胆汁淤积性疾病的肝细胞中根蛋白与MRP2不再具有共区域化作用，其交互作用也相应丧失[5,6]。ERM蛋白并不是静态粘附蛋白，事实上它们存在两种形式：(1)未激活的休眠状态，ERM结合域与其特定的PDZ域发生交互作用，从而阻止了ERM蛋白与其他PDZ包含蛋白如MRP2等的交互作用；(2)激活状态，通过第567位点(哺乳类动物埃兹蛋白的T567)的苏氨酸残基磷酸化后，ERM蛋白内在交互作用丧失，此时ERM蛋白可与其他锚定蛋白的PDZ域相结合[8]。

蛋白激酶C(PKC)信号通路对细胞活化、凋亡、迁移和细胞毒效应等多种生理功能具有调节作用，是一条重要的细胞内信息传递通道。众所周知胆汁淤积是PKC的激活剂。根据Ito等[9]研究，PKC信号通道可能激活MRP2的转运。Chai等[10]就上述问题进行研究的结果表明，在胆汁淤积小鼠模型中，活化的埃兹蛋白与MRP2可发生交互作用，这和蛋白在细胞内囊泡中发生重定位有关。通过免疫沉淀反应可以发现在患有胆汁淤积性疾病患者的肝脏中，MRP2并不与根蛋白发生交互作用，取而代之的是与可通过第567位点苏氨酸残基磷酸化激活的埃兹蛋白发生交互作用。同时研究还表明埃兹蛋白在保守的C端苏氨酸残基的磷酸化由蛋白激酶C(a、d和e)介导。而之前MRP2可在细胞内囊泡中进行的泛素化-蛋白酶体降解途径也会相应消失。在非胆汁淤积性的肝脏模型中，MRP2与根蛋白存在交互作用。因此推测在正常生理情况下MRP2与根蛋白交互作用，使其定位和(或)维持在毛细胆管膜上某一位点上的活性。但在胆汁淤积的情况下，MRP2与根蛋白交互作用丧失，磷酸化的埃兹蛋白取而代之与MRP2相结合，并使其直接定位在细胞内。上述结果部分解释了毛细胆管浆膜中MRP2对解除胆汁淤积的复杂信号通路。

三、存在的问题

尽管如此，仍然存在许多问题。首先，在胆汁淤积的条件下，其他毛细胆管ABC转运蛋白如BSEP和P-糖蛋白在毛细胆管浆膜中也发生了重定位，但是这些蛋白与ERM蛋白是否发生交互作用目前尚未明确。并且P-糖蛋白的重定位以及BESP对Radixin-/-的小鼠影响甚微。Ortiz等[11]研究表明BSEP(和P-糖蛋白)的转运依赖于HAX-1。因此，在胆汁淤积的情况下极有可能存在其他机制在毛细胆管膜中维持这些蛋白的活性以及使其在细胞内进行重定位。其次，埃兹蛋白和根蛋白的功能无特定的细胞类型，如埃兹蛋白可与MRP2发生交互作用，使其在肠道细胞顶端定位[12]。此外，在正常情况下磷酸化的埃兹蛋白可与MRP2发生交互作用，将其定位在肠道细胞中的顶端，在胆汁淤积情况下，磷酸化的埃兹蛋白还与肝细胞毛细胆管膜中MRP2的撤回密切相关[13]。显而易见，我们还需要进行大量的研究工作，才能明确上皮细胞顶端膜中ABC转运蛋白的转运机制。

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(本文编辑：张苗)

2016-02-01)

200080上海交通大学附属第一人民医院消化科