地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞Bax/Bcl-2表达的影响

裴志勇，张健，尹巧香，杨桂利，赵玉生

(1.北京军区总医院干部病房一科，北京 100700；2.空军总医院干部病房心内科；3.军事医学科学院基础医学研究所前沿交叉学科研究室；4.解放军总医院老年心血管病研究所)



·基础研究·

地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞Bax/Bcl-2表达的影响

裴志勇1，张健1，尹巧香2，杨桂利3，赵玉生4

(1.北京军区总医院干部病房一科，北京 100700；2.空军总医院干部病房心内科；3.军事医学科学院基础医学研究所前沿交叉学科研究室；4.解放军总医院老年心血管病研究所)

[摘要]目的探讨地黄低聚糖(RGOs)对过氧化氢-血清饥饿诱导的小型猪脂肪组织来源干细胞(ASCs)Bax、Bcl-2表达的影响。方法过氧化氢(200μM)联合血清饥饿(H2O2/SD，6 h)建立小型猪ASCs凋亡模型。RGOs(0.01 g/L、0.1 g/L、1 g/L、10 g/L)预处理12 h并继续干预6 h。Western-blot法测定细胞Bax、Bcl-2的表达。结果RGOs在一定浓度范围(0.1 g/L～10 g/L)可以减轻H2O2/SD引起的ASCs损伤，表现在Bax表达下调，Bcl-2表达上调。结论地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞的凋亡具有保护作用。

[关键词]干细胞移植；地黄；细胞凋亡；过氧化氢；Bcl-2相关X蛋白质；模型, 动物

干细胞移植治疗急性心肌梗死(AMI)是心血管再生领域研究的新策略，但梗死区缺血、缺氧造成的恶劣环境可引起移植干细胞大量凋亡，大大降低了移植效率。可见，改善缺血心肌恶劣的微环境是提高干细胞存活率的关键。地黄低聚糖(RGOs)系从地黄中分离提取的一种多糖成分，具有广泛的药理作用，但对于其是否具有抗凋亡作用研究较少。本研究拟采用过氧化氢(H2O2)联合血清饥饿(SD)模拟AMI后局部心肌缺血、缺氧的微环境，诱导体外培养的小型猪脂肪组织来源干细胞(ASCs)损伤，观察不同浓度RGOs对ASCs表达Bax、Bcl-2的影响。

1材料与方法

1.1实验动物广西巴马小香猪，雌雄不拘，体质量20～30 kg，由解放军总医院实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK(军)2007-009。

1.2材料L-DMED培养基、特级胎牛血清(FBS)、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶(Gibco公司)，Dispase Ⅱ中性蛋白酶(Sigma公司)；30 %过氧化氢溶液(北京化工厂)。兔抗Bax多克隆抗体(Assay designs/stressgen公司)，小鼠抗Bcl-2 单克隆抗体(Santa cruz公司)，硝酸纤维素膜(美国Bio-Rad公司)，BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)，Kodak BioMax MR X-光片(美国 Kodak)。二氧化碳孵箱(美国 Thermo scientific公司)，普通光学显微镜(德国 Leica DM IL)，倒置相差显微镜(日本 Olympus BX51)，低温离心机(美国 Sigma 3K18)。RGOs以生地黄为原料加工后经军事医学科学院毒物药物研究所提纯，高效液相色谱法检测RGOs提纯物中水苏糖含量为31.15 %。

1.3方法

1.3.1小型猪ASCs的分离与培养无菌条件下取小型猪腹股沟区脂肪组织5～8 g，冰PBS冲洗3次，去除血污、筋膜及血管，剪碎呈糊状；加入20 mL消化液(L-DMEM+0.1%Ⅳ型胶原酶+0.1%Dispase Ⅱ中性蛋白酶+0.1%胰蛋白酶)，置于37℃孵箱振荡消化40～60 min；加入等量含10% FBS的L-DMEM培养基终止消化，100目、200目筛网过滤，600 g离心6 min；弃上清，加入含10% FBS的L-DMEM培养基重悬细胞，移入培养皿，置于37℃、5% CO2孵箱中培养。24 h后首次换液，随后每2～3 d换液1次。约1周左右细胞融合80%～90%，加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA溶液消化、传代。倒置显微镜观察原代及传代的ASCs形态学特点。

1.3.3Western-blot测定Bax、Bcl-2的表达RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法检测样品蛋白浓度，将蛋白样品和蛋白上样缓冲液按1∶4(V∶V) 比例混合，100℃加热5 min 使蛋白变性。以分离胶浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白电泳，电泳完毕后将蛋白湿转至硝酸纤维素膜，转膜结束经含有5%脱脂奶粉室温封闭1 h，杂交洗液TTBS漂洗3次，加入一抗(Bcl-2，1∶200；Bax，1∶200)，4 ℃过夜；次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗，以ECL化学发光法进行检测。β-actin 为内参对照。

1.3.4Western blot条带灰度值测定用Gel-Del凝胶成像系统对X-光片进行扫描，计算灰度值(条带面积×条带密度)。凋亡蛋白(Bax、Bcl-2)表达以各组灰度值与对照组(Control)灰度值的比值表示。

1.4统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，多组之间比较先采用F检验，后采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1小型猪ASCs形态学观察原代细胞接种24 h后首次换液，可见大量贴壁细胞，多呈圆形或椭圆形，少数呈梭形、三角形或多角形，有粗大突起，核居中，细胞质内可见大量大小不等透明圆泡及细小颗粒。72 h后，细胞较前伸展变大，形状如前。7 d左右细胞融合达80 %～90 %，可按1∶3传代。传代后的细胞数小时可完全贴壁，生长较迅速，5 d左右可再次传代。2～3次传代后细胞多呈三角形、多角形或星形。

2.2Bax、Bcl-2的表达图1示各组Bax、Bcl-2表达条带。各组Bax表达半定量统计分析显示：单纯H2O2/SD组(0 g/L)Bax的表达明显高于Control组(P<0.01)，给予不同浓度RGOs干预后，0.01～10 g/L组Bax的表达明显下降(P<0.05,P<0.01)(图2)。各组Bcl-2表达半定量统计分析显示：单纯H2O2/SD组Bcl-2的表达明显低于Control组(P<0.01)，给予不同浓度RGOs干预后，0.01～10 g/组Bcl-2的表达明显升高(P<0.05,P<0.01)(图3)。综上所述，RGOs可通过下调Bax的表达，上调Bcl-2的表达而发挥抗凋亡作用。

3讨论

细胞凋亡受多条信号通路调控，其中最重要的调节因子就是Bcl-2家族，该家族根据功能不同分为两类：一类是促凋亡成员如Bax、Bad等，其通过提高线粒体的外膜通透性，增加线粒体中细胞色素C的释放，激活效应caspase，最终导致细胞凋亡；另一类是抗凋亡成员如Bcl-2、Bcl-xl 等，其能够通过稳定线粒体膜阻止细胞色素C 的释放，从而对线粒体凋亡途径起负调控作用[2]。

地黄是一味重要的滋阴补肾中药，近年来国内外学者对其进行了大量研究，实验和临床研究都证实其在免疫、血液及造血、内分泌、心血管、神经系统等方面具有广泛的药理活性。体外研究证实，RGOs具有促进动物骨髓干细胞、骨骼肌成肌细胞及ASCs增殖、分化的功能[3-4]。地黄多糖具有补血、降血糖、抗肿瘤、增强免疫及保护心脑组织避免ATP耗竭和缺血损伤的作用，多位学者对于地黄及其组分抗氧化损伤的机制也进行了研究。樊淼等[5]研究发现，地黄寡糖、水苏糖、梓醇均可改善H2O2所致脑组织的损伤，减少乳酸脱氢酶的漏出。Hu等[6]研究发现，梓醇预处理可以明显减轻H2O2所致人脐静脉内皮的凋亡，其作用机制与清除氧自由基、激活PI3K/Akt-Bad信号通路，上调Bcl-2表达及下调Bax有关。蒋青等[7]研究发现，地黄寡糖能够显著减少脑缺血再灌注损伤所致的大鼠海马CA1区神经元凋亡，其作用机制可能是通过调控Bcl-2/Bax相关蛋白的表达来实现的。我们前期的研究发现[8]，RGOs在一定浓度范围(0.1～10 g/L)可以减轻H2O2/SD引起的ASCs损伤，表现在细胞活性增加，细胞凋亡率下降。为了进一步明确RGOs抗凋亡的作用机制，我们采用Western-blot法对Bax、Bcl-2的表达进行检测，结果显示，RGOs在一定浓度范围(0.1～10 g/L)可以减轻H2O2/SD引起的ASCs损伤，表现在Bax表达下调，Bcl-2表达上调。提示RGOs可能通过调节Bcl-2家族蛋白的表达发挥抗凋亡作用。本文仅对RGOs抗氧化应激损伤的机制进行了初步探讨，具体的作用机制有待进一步深入研究。

(本文图1～3见插图1-1)

参考文献

[1]裴志勇，赵玉生，高伟，等.过氧化氢-血清饥饿诱导脂肪组织来源干细胞凋亡模型的建立[J].中国临床保健杂志，2012,15(3)：264-267.

[2]Morishita N，Tsukahara H，Chayama K，et al.Activation of Akt is associated with poor prognosis and chemotherapeutic resistance in pediatric B-precursor acute lymphoblastic leukemia[J].Pediatr Blood Cancer，2012，59(1): 83-89.

[3]裴志勇，赵玉生，高伟，等.地黄低聚糖对体外培养的小型猪脂肪组织来源干细胞增殖的影响[J].中国临床保健杂志，2012,15(6)：615-618.

[4]Hughes PD,Belz GT,Fortner KA,et al.Apoptosis regulators Fas and Bim cooperate in shutdown of chronic immune responses and prevention of autoimmunity[J].Immunity,2008,28(2):197-205.

[5]樊淼，杨菁，白剑，等.地黄寡糖及其主要成分对大鼠脑片氧化应激损伤保护作用研究[J].中药药理与临床，2009，25(5)：64-67.

[6]Hu L，Sun Y,Hu J.Catalpol inhibits apoptosis in hydrogen peroxide-induced endothelium by activating the PI3K/Akt signaling pathway and modulating expression of Bcl-2 and Bax[J].Eur J Pharmacol,2010,628(1/2):155-163.

[7]蒋青，沈明勤，石磊，等.地黄寡糖对血管性痴呆大鼠海马区神经细胞.凋亡及相关蛋白表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(3)：192-196.

[8]裴志勇，赵玉生，高伟，等.地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导脂肪组织来源干细胞凋亡的影响[J].中国临床保健杂志，2014,17(5)：519-522.

Effect of Rehmannia glutinosa oligosaccharides on Hydrogen peroxide-and serum deprivation-induced apoptosis in miniswine adipose tissue-derived stem cellsPeiZhiyong*,ZhangJian,YinQiaoxiang，YangGuili,ZhaoYusheng(*DepartmentofGeriatricCardiology,BeijingMilitaryGeneralHospital,Beijing100700,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of Rehmannia glutinosa oligosaccharides (RGOs) on hydrogen peroxide-and serum deprivation-induced apoptosis in adipose tissue-derived stem cells.MethodsAn apoptosis model in miniswine adipose tissue-derived stem cells (ASCs) was established by hydrogen peroxide-and serum deprivation-induced (H2O2/SD,6h)in vitro.RGOs (0.01g/L,0.1g/L,1g/L,10g/L) pretreated for 12 hours and continued presence for 6 hours.Expression of Bax and Bcl-2 was investigated by using Western blot analysis.ResultsRGOs significantly attenuated hydrogen peroxide-and serum deprivation-induced ASCs apoptosis,showing a down-regulated Bax expression and an up-regulated Bcl-2 expression with the concentrations between 0.1g/L-10g/L.ConclutionRehmannia glutinosa oligosaccharides can protect adipose tissue-derived stem cells against hydrogen peroxide-and serum deprivation-induced apoptosis.

[Key words]Stem cell transplantation；Rehmannia glutinosa；Apoptosis；Hydrogen peroxide；Bcl-2-Associated protein;Models, Animal

(收稿日期：2015-12-01)

中图分类号:R617

文献标识码:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.01.023

作者简介：裴志勇，博士，副主任医师，Email:peizy6618222@sina.com

基金项目：国家高科技研究发展计划(2006AA02A105)