AQP4基因沉默对脑水肿的影响及影像改变

蒋锡丽　鲁　宏　陈建强　谢树才

AQP4基因沉默对脑水肿的影响及影像改变

蒋锡丽1鲁宏2*陈建强1谢树才3

脑水肿的发生机制十分复杂，细胞内Ca2+超载、自由基损害、细胞膜Na+,K+-ATP酶活性降低等均与脑水肿的形成相关，但这些机制并不能很好地解释脑水肿的发生。近年来分子水平上水通道蛋白4（AQP4）的研究为探索脑水肿的发生机制带来了突破性进展。AQP4参与脑水肿的形成。AQP4基因沉默降低了AQP4的表达并能减轻脑水肿的程度。就AQP4基因沉默对脑水肿的影响及影像改变进行综述，以期为脑水肿的诊治提供有效的理论依据。

水通道蛋白4；基因沉默；RNA干扰；脑水肿；磁共振成像

Int J Med Radiol，2016，39（5）:495-499

脑水肿常继发于颅脑外伤、脑血管疾病以及颅内肿瘤等疾病，是造成颅内高压的直接原因，也是导致临床高病死率、高致残率的关键因素。文献报道脑水肿是急性脑缺血神经功能恶化和死亡的最常见病因[1]。因此，对脑水肿的及时诊断和治疗是非常重要的临床课题。实验证明水通道蛋白（aquaporin，AQP）4与脑水肿的形成密切相关[2-3]。AQP4基因沉默可以下调AQP4的表达并能减轻脑水肿的程度。AQP4基因沉默将为治疗脑水肿的新药开发带来新希望。

1　AQP4

AQP是一类广泛分布于细胞膜上、调节细胞水代谢的蛋白家族。目前发现AQP有13种亚型（AQP0～AQP12）。AQP4是脑内分布最多的AQP[4]，是星形胶质细胞的双向水输送蛋白[5]。Nielsen等[6]研究发现AQP4广泛存在于蛛网膜下腔、脑室及血管周围的神经胶质细胞、室管膜细胞及下丘脑视上核、穹窿下器等渗透压感受区器官。AQP4通过α-肌营养不良蛋白（α-syntrophin）与抗肌萎缩蛋白（dystrophin）固定于星形胶质细胞[7]。有研究[8-9]发现α-syntrophin缺失或dystrophin缺失会使小鼠星形胶质终足及胶质界膜处AQP4的表达显著下降，从而减轻脑水肿。这些研究表明AQP4与水平衡及脑水肿有关。另有研究报道AQP4与星形胶质细胞迁移和神经胶质瘢痕的形成[10]、星形胶质细胞的Ca2+的释放[11]及体内K+平衡的调节[12]等有关。

2　脑水肿

脑水肿病理上主要分为4种，分别为细胞毒性水肿、血管源性脑水肿、间质性脑水肿和渗透性脑水肿。①细胞毒性水肿，又称为细胞内水肿，血脑屏障保持完整，细胞内水钠潴留，细胞肿胀，胞外间隙变窄，常见于水中毒、脑缺血。②血管源性脑水肿是由于血脑屏障遭到破坏，血浆胶体渗透压增高，血管内蛋白和液体渗透到细胞间隙而形成，常见于脑部外伤、肿瘤、局部炎症、缺血性脑梗死及脑出血晚期。③间质性脑积水，又称为脑积水性脑水肿，是由于脑脊液吸收障碍，脑室内压升高，脑脊液渗透到脑内，扩散至脑室旁白质，常见于梗阻性脑积水。④渗透性脑积水是由于下丘脑下部-垂体轴功能受损，促肾上腺皮质激素和抗利尿激素分泌失调，从而血浆胶体渗透压降低引起的脑白、灰质神经细胞内水肿。

在脑水肿的过程中，各种类型的脑水肿并不是单一存在的，常以血管源性脑水肿、细胞毒性水肿多见。鲁等[13]研究报道缺血性脑损伤时在2 h内的病理改变为细胞毒性水肿，4～6 h表现为血管源性水肿。张等[14]研究脑挫裂模型发现，脑挫裂侧24 h内出现血管源性水肿，而后出现细胞毒性水肿；24～72 h主要表现为以细胞毒性水肿为主的混合性水肿。同时观察非挫伤侧，6 h出现细胞毒性水肿，24 h出现血管源性水肿并存的混合性脑水肿，48 h细胞毒性水肿仍然存在，而血管源性水肿缓解，72 h细胞毒性水肿仍然很明显。由此可见，不同原因造成的水肿，甚至同一原因引起的不同部位的水肿，其水肿的病理过程也不相同。

3　AQP4与脑水肿的相关性

3.1AQP4与细胞毒性水肿Katada等[15]研究报道，脑缺血时AQP4敲除小鼠神经细胞肿胀显著减轻，小鼠生存率大大提高。Yao等[16]报道局灶性脑缺血后AQP4缺失能减轻脑水肿程度和梗死体积。Yang等[17]在急性水中毒模型中发现AQP4的过度表达会促进细胞性脑水肿的形成，常常导致脑疝和脑死亡的发生。Rama等[18]研究发现急性肝功能衰竭导致的脑水肿主要表现为细胞毒性水肿，随着AQP4表达水平的增高脑水肿变得更严重。以上实验均证实了AQP4与细胞毒性水肿呈正相关，AQP4表达上调是细胞内水肿的原因[19]。也有研究者得出相反结果，认为AQP4表达下降是细胞水肿的主要原因[20]。

3.2AQP4与血管源性水肿Bloch等[21]发现脑脓肿与血管源性水肿有关，AQP4基因缺失可增加脑脓肿局部脑水肿的程度。因此诱导AQP4基因的表达可降低脑感染引起的血管源性水肿。Tait等[22]发现蛛网膜下腔出血后6～24 h，AQP4缺失小鼠比野生小鼠的神经功能评分低、颅内压高、脑水肿更严重。Papadopoulos等[23]研究在小鼠连续脑实质内输液、冻伤及脑肿瘤发生的血管源性水肿中，AQP4缺失小鼠比野生小鼠水肿更严重。以上实验说明了AQP4能促进脑内水分的清除，从而减轻脑水肿。Lu等[24]还报道AQP4在血管源性水肿时表达下调与机体的防御反应有关。

然而有研究者持不同的观点，认为发生血管源性脑水肿时AQP4表达上调。Taya等[25]发现AQP4的上调会导致水的清除功能下降或者血脑屏障的损伤，从而导致血管源性水肿加重。沈等[26]研究报道，人脑挫裂伤24 h内AQP4的表达与血脑屏障指数变化呈正相关，24 h后则无明显关系，这说明了脑损伤后血脑屏障的损坏是早期脑水肿主要原因。

总之,AQP4表达上调或下调都会影响脑水肿的形成，而AQP4与细胞毒性脑水肿或血管源性脑水肿的关系尚无定论。这可能是脑损伤的模型、使用的方法及实验者观察的时间有差异造成的。近年针对AQP4基因沉默治疗脑水肿的研究日趋升温。

4　AQP4基因沉默与脑水肿

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由同源双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)引起的转录后基因沉默的过程[27]。它是目前研究特定基因功能的常用方法[28]。小片段干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）是由dsRNA分裂成21～23核苷酸长的小RNA分子，经人工体外合成，通过转染进入人体内。siRNA是RNAi过程中的产物，在RNA沉默通路中起重要作用。AQP4 siRNA能与AQP4 mRNA特异性结合，从而降解AQP4 mRNA，阻止其转录后翻译，达到抑制AQP4蛋白表达的效果。

大量研究报道AQP4基因沉默能抑制AQP4表达，从而不同程度地减轻脑水肿。Rao等[29]研究发现细胞毒性水肿是早期创伤性死亡的主要原因，siRNA沉默AQP4基因表达能明显减轻创伤性胶质细胞水肿。Rama等[30]发现在急性肝功能衰竭模型中对胶质细胞AQP4基因进行沉默能防止氨诱导的细胞毒性水肿。楚等[31]研究发现RNAi抑制AQP4的表达可以减轻颅脑爆炸伤后细胞毒性脑水肿，但对血管源性脑水肿的影响程度较小。何等[32]在AQP4基因沉默治疗早期脑梗死研究中发现AQP4基因沉默能有效缓解细胞毒性水肿，但对血管源性水肿无明显效果。以上研究表明AQP4基因沉默能有效治疗细胞毒性水肿，但对血管源性水肿是否有效仍存在争议。AQP4基因沉默是否能缓解血管源性水肿可能与AQP4对血脑屏障的作用有关。

AQP4是否会引起血脑屏障的破坏，就这一问题仍存在争议。吕等[33]研究在创伤性脑水肿中RNAi组与创伤性脑损伤组和对照质粒组比较，在各时间点测得的脑组织含水量和血脑屏障通透性均小，该实验说明了RNAi对创伤性脑水肿血脑屏障具有保护作用。Eilert-Olsen等[34]研究发现AQP4基因沉默会减少AQP4蛋白的表达，但并不破坏血脑屏障通透性。然而Zhou等[35]研究发现AQP4基因敲除小鼠血脑屏障具有较高的通透性。

AQP4基因沉默能减轻脑水肿的程度，但其在治疗脑水肿的同时是否会引起正常脑组织结构的改变呢？石等[36]报道在脑组织正常生理状态下，单纯提高AQP4表达程度并不影响脑组织结构和代谢情况。这可能是因为只有在病理状态下AQP4才起主要的调节作用，在正常生理状态下除AQP4外还有其他类似功能的蛋白质参与脑组织水平衡。这也说明在正常生理状态下AQP4的上调或下调并不影响正常脑组织功能。Badaut等[37]对正常脑组织进行基因沉默研究发现，注射RNA干扰剂后双侧皮质及纹状体表观扩散系数（apparent diffusion coefficient, ADC）均显著降低。虽然AQP4基因沉默导致同侧皮质细胞通透性减弱，但并不改变对侧血脑屏障的通透性。这一实验证明AQP4 RNA对注射部位周围及远处的正常脑组织影响不大。以上论述为AQP4基因沉默治疗脑水肿提供了很好的依据。

虽然AQP4基因干扰具有高效性和特异性，但仍然存在费用高、操作复杂、作用时间短等问题。AQP4 RNA干扰剂进入机体的途径仍存在争议。目前文献报道有经静脉、侧脑室、皮质及基底节区直接注射等多种给药途径。血浆中存在siRNA降解酶，将体外合成的RNA干扰片段大剂量经静脉注射，AQP4 mRNA表达很少且作用时间短。用脂质体包裹AQP4短发夹环质粒经侧脑室注入能起到很好的基因沉默效果，作用的稳定性也大大提高。因为侧脑室对siRNA的通过性很低，但血脑屏障对脂质的通过性很高，所以RNA干扰剂能很快进入机体发挥作用；但除脑出血、脑肿瘤需行开颅手术外一般情况不会通过侧脑室或直接皮质、基底节区给药，因此何种给药途径是最佳途径仍有待研究。

5　AQP4基因沉默与脑水肿影像学改变

5.1脑水肿MRI表现扩散加权成像（resonancediffusionweightedimaging，DWI）常用于超早期脑缺血诊断，现在也越来越多地应用于脑部疾病的检查。DWI不仅可以测量局部水分子扩散运动的强度，而且能测得水分子扩散运动的主方向，从而提供超出形态描绘的组织信息，可对病理过程进行评估[38]。何等[39]研究报道DWI是诊断早期脑缺血的首选成像方法，其次是T2液体衰减反转恢复（fluid attenuated inversion recovery，FLAIR）序列。DWI高信号主要反映细胞毒性水肿，DWI高信号面积增大表明细胞毒性水肿加重；T2FLAIR高信号主要反映混合性脑水肿；T2WI高信号只能反映血管性水肿。细胞毒性水肿时，DWI高信号，ADC值降低；血管源性水肿时，DWI低信号，ADC值升高。

5.2AQP4基因沉默与脑水肿MRI改变Badaut等[37]在小鼠脑组织中注射AQP4 RNA干扰剂，发现27%的AQP4基因沉默诱导ADC值降低了50%，实验表明在正常脑组织中ADC值的大小受胶质细胞AQP4的调控。Lu等[40]研究在缺血性脑水肿早期，RNA干扰组与对照组比较，在0.5～4 h内，ADC值明显升高，而AQP4及AQP4 mRNA的表达明显减弱，细胞水肿程度显著减轻。这一实验证明AQP4表达上调是细胞毒性脑水肿形成的主要分子机制，也是ADC值降低的分子基础。He等[41]研究在脑梗死0.5～6 h内，T2WI和DWI上高信号区面积逐渐扩大，进行AQP4基因沉默后T2WI和DWI上高信号区面积减少，相对ADC值升高，细胞水肿显著缓解。脑梗死后6 h治疗组ADC值与模型组比较基本相似，治疗组在血管源性水肿中ADC值仍比较高。该实验表明AQP4基因沉默能有效缓解细胞水肿，ADC值、T2WI和DWI高信号区能反映AQP4基因沉默治疗细胞水肿的效果，但AQP4基因沉默对血管源性水肿作用效果不明显。以上实验均证实了ADC值能间接反映AQP4的表达水平，AQP4 mRNA表达与ADC值呈负相关。

6　小结

综上所述，AQP4与脑水肿的密切关系为AQP4基因沉默治疗脑水肿提供了理论基础。AQP4基因沉默能有效地减轻脑水肿，而AQP4基因沉默后MRI影像的改变能间接反映治疗效果。然而AQP4基因沉默应用于临床治疗仍有一些问题有待解决，如AQP4进入人体的最佳途径尚不明确。此外，AQP4基因沉默作用有时间依赖性[42]，加之不同原因造成的脑水肿病理过程不同，AQP4基因沉默对细胞水肿及血管源性水肿的作用效果不同，这3个因素使AQP4基因沉默作用需要确定一个最佳治疗时间，这样才能达到最好的治疗效果。

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（收稿2015-12-25）

The effects of AQP4 gene silencing on brain edema and corresponding imaging changes

JIANG Xili1,LU Hong2,

CHEN Jianqiang1,XIE Shucai3.1 Department of Radiology,Affiliated Haikou Hospital Xiangya School of Medicine,Central South University(Haikou People’s Hospital),Haikou 570208,China;2 Department of Radiology,The Seventh People’s Hospital of Chongqing;3 Department of Hepatobiliary Surgery,Affiliated Haikou Hospital Xiangya School of Medicine, Central South University(Haikou People’s Hospital)

The mechanism of cerebral edema is complex.The intracellular Ca2+overload,free radical damage,and reduction of Na+～-K+～-ATPase activity in cell membrane are associated with the formation of brain edema,but these mechanisms hardly explain the occurrence of cerebral edema exactly.In recent years,the study of aquaporin4(AQP4)at molecular level brings a breakthrough to make the mechanism of cerebral edema clear.A number of experimental studies have shown that AQP4 is closely related to the formation of cerebral edema.It has been reported that AQP4 gene silencing which reduces the expression of AQP4 can reduce the extent of brain edema.The purposes of this article were to explore the effects of AQP4 gene silencing on brain edema and corresponding imaging changes and to provide theoretical basis for the diagnosis and treatment of cerebral edema.

Aquaporin-4;Gene silencing;RNA interference;Brain edema;Magnetic resonance imaging

10.19300/j.2016.Z4058

R741.02；R445.2

A

1中南大学湘雅医学院附属海口医院（海口市人民医院）放射科，海口570208；2重庆市第七人民医院放射科；3中南大学湘雅医学院附属海口医院（海口市人民医院）肝胆外科

鲁宏，E-mail：471739847@qq.com

*审校者

国家自然科学基金项目（81160181）