微小RNA治疗学及其在冠心病中的应用研究进展

梁宝今 梁 涛 周卓东 蒙如庆

(1 右江民族医学院研究生学院，百色市 533000，E-mail：liangbaoj@126.com；河池市人民医院2 心血管内科，3 肾内科，河池市 547000)

微小RNA治疗学及其在冠心病中的应用研究进展

梁宝今1梁 涛2周卓东2蒙如庆3

(1 右江民族医学院研究生学院，百色市 533000，E-mail：liangbaoj@126.com；河池市人民医院2 心血管内科，3 肾内科，河池市 547000)

人类基因组90%以上是由非编码RNA组成的，而微小RNA(miRNA)是一类可调控基因表达的内源性非编码RNA，通过与靶基因3′UTR结合，调控mRNA转录后水平，参与细胞增殖、分化、凋亡、胚胎发育、血管形成等病理生理过程。随着miRNA在冠心病的作用不断被阐明，促进了miRNA治疗学的发展，包括miRNAs拮抗剂、miRNA海绵、反义寡核苷酸等。本文就近年来针对miRNA治疗学及其在冠心病领域的应用研究作一综述。

微小RNA；冠心病；治疗；综述

冠心病(coronary heart disease，CHD)是目前最常见的心血管疾病之一，是危害人类健康和导致死亡的主要疾病。目前，CHD的主要治疗方法有药物治疗、经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术等方法。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类大约由18～23个核苷酸组成的内源性非编码RNA，与蛋白质编码基因3′端非翻译区结合，在转录后水平上对基因的表达进行调控[1]。是CHD发生的关键调节剂。miRNA的发展促进了miRNA治疗学的发展，包括miRNAs拮抗剂、miRNA海绵、反义寡核苷酸等。近年来随着生命遗传学飞速发展，其也逐步应用于心血管疾病。现就基于miRNA治疗学及其在CHD中的应用综述如下。

1 miRNA的生物学特性及其与CHD的关系

心血管疾病是全球死亡的重要原因，冠状动脉粥样硬化性疾病具有较高的死亡率，临床上需要一种新的诊断方法和治疗策略以降低发病率。随着miRNA在CHD中的调控作用逐渐阐明，以miRNA为基础的治疗方式成为重要研究内容。miRNA在形成过程中经历3种形式：初级miRNA、前体miRNA、成熟的miRNA。数以千计的人类蛋白质基因通过miRNA调节表达，尤其在血细胞生成期间，miRNA是一类重要的负性调节剂[2-3]。miRNA通过与mRNA靶基因的3′-UTR区互补配对，抑制靶mRNA的翻译，进而参与血细胞的发育、分化、凋亡，以及激素分泌和某些生物过程，如信号转导的调节。最新的研究表明，许多miRNA参与血小板相关基因的表达[4-5]。miRNA已被证实参与急性冠状动脉综合征发病机制，包括动脉粥样硬化斑块的破裂、血小板激活和聚集以及冠状动脉闭塞后心肌细胞的死亡[6-8]。大量的miRNA以组织特异性方式表达，并且可进入到血浆和尿液中[7，9]。特定的miRNA参与动脉粥样硬化内皮功能障碍引发的斑块破裂阶段，是CHD早期诊断和治疗靶标的潜在生物标志物。在急性心肌细胞梗死的动物模型及ST段抬高性心肌梗死(STEMI)患者中，miRNA-1、miRNA-133A、miRNA-208、miRNA-208b、miRNA-499以及miRNA-499-5P有显著变化，并且认为可作为心肌损伤的潜在生物标志物[10]。miRNA-126具有调控黏附分子表达及血管炎症反应功能，在CHD中对冠状动脉粥样硬化的发展过程起保护作用[11]。

2 miRNA生物学疗法

2.1 miRNA拮抗剂 miRNA拮抗剂是单链RNA分子，通过碱基互补配对方式与miRNA结合，是寡核苷酸特异性沉默单个内源性miRNA的一类化学制剂。对miRNA拮抗剂进行化学修饰，可使其具有抗核酸酶的作用并利于细胞吸收。miRNA的组织特异性和靶向性的特点使靶标研究有治疗价值，可以通过miRNA拮抗剂来抑制miRNA[12]。成熟的miRNA与Argonaute2蛋白等结合，构成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，通过竞争性地结合到成熟的靶miRNA[12]，导致RISC的激活减少，从而调节特定的mRNA水平和基因表达水平[13]。利用化学稳定的互补寡核苷酸或者其活性模拟物可以抑制miRNA。抗-miRNA不可逆地结合于互补的靶miRNA序列，miRISC复合物阻断加工过程，但该机制还没有得到充分的证实。把抗miRNA基因编码末端的2-0-甲基与胆固醇连接起来，可以产生RNA拮抗剂。抗-miRNA和miRNA拮抗剂大多作用于啮齿动物中，只有少部分研究采用灵长类动物模型。其中，有研究表明，miRNA-33抑制剂在灵长类动物非洲绿猴身上通过上调肝脏三磷酸腺苷结合盒转运体A1编码基因水平从而上调高密度脂蛋白水平来抵抗miRNA[14]。miRNA拮抗剂对血脂异常的治疗是有效的，但是也面临着有关特异性和靶向递送的挑战。

2.2 miRNA海绵 减少miRNA的量和降低miRNA效果的另一种方式是miRNA海绵。miRNA海绵是一种miRNA靶基因的竞争性抑制剂，是将若干个miRNA的反义序列串联在一起，连接到合适的载体中表达，其转录物“吸附”相应的miRNA，与miRNA靶基因形成竞争，导致靶基因去抑制化。竞争性抑制剂通过作用于miRNA家族结合位点，阻断miRNA活性[15]。这样抑制剂可以暂时从转染的质粒中表达或稳定地插入染色体中。通过将miRNA海绵与完整或不完整的互补miRNA结合，使受影响的miRNA不能与原来的mRNA结合位点结合，从而降低mRNA和基因表达的效果[12]。相对于拮抗剂，miRNA海绵仅仅特定于一个miRNA的种子区，因此能够阻断miRNA家族。将编码miRNA结合位点的序列整合人宿主细胞可实现海绵转录物持续、稳定、高效、安全地表达。miRNA海绵可抑制具有相同种子序列的miRNA，这对基因敲除是有利的，但抑制目标miRNA时可能也会对其他miRNA产生影响。

2.3 miRNA反义核酸技术 反义核酸技术通过设计针对靶序列的反义核酸，特异性抑制靶基因的表达。一种反义抑制剂只针对一种miRNA，要抑制整个miRNA家族，需要有多种反义寡核苷酸(anti-sense oligonucleotides，ASOs)混合物。寡核苷酸通常有15～23个核苷酸长度，2′甲氧基插入核糖体环中进行化学修饰，以增加它们的稳定性和减少DNA酶的易感性。ASOs对于单一蛋白减少的治疗是有益的。ASOs是具有高度特异性的单个基因单链互补序列，通过酶H裂解转录物中断mRNA的翻译。这可以防止靶mRNA被翻译，减少蛋白质的表达。ASOs可通过静脉内输注或皮下注射转运至肾、肝、脾、脂肪细胞和骨髓，但不能通过血脑屏障[16]。miRNA同时针对多个mRNA抑制相似或相同途径的基因，从而改变生物网络[16]。在疾病状态下，miRNA的异常调节能够改变基因网络，miRNA的替代疗法或反义抑制作用可以使细胞基因表达恢复到正常状态[16]。

3 miRNA治疗与CHD

3.1 miRNA治疗与心肌梗死 Ren等[17]发现miRNA-320的抑制作用是通过使用miRNA-320拮抗剂导致梗死面积显著减少；体外诱导的心肌梗死大鼠模型表明miR-320基因沉默可以减少细胞的死亡和凋亡。Ye等[18]发现通过在缺血再灌注模型小鼠中使用miRNA-29反义抑制剂，能够保护心肌细胞免受损伤。β2肾上腺受体拮抗剂抑制心肌梗死后心肌细胞钙超载，在体内抗-miRNA对miRNA-let-7的抑制作用促进了β2肾上腺受体的表达，使在心血管疾病患者中使用肾上腺素拮抗剂更加复杂化。长期使用miRNA治疗剂的副作用可以通过特定组织miRNA调节来缓解，如通过靶向递送miRNA治疗剂或者特异性表达的受限组织miRNA，以及生化过程中特异性调节的miRNA。Quiat等[19]发现miRNA-29治疗剂靶向治疗心肌梗死、减少瘢痕形成时，可能会损伤主动脉血管的完整性，通过递送miRNA-29模拟物及使用药物洗脱冠脉支架，可以防止这种不良后果。

3.2 miRNA治疗与高脂血症 他汀类降脂药可有效地降低低密度脂蛋白(LDL)水平，但部分患者服用他汀类药物后会出现肌痛等副作用，甚至出现他汀抵抗现象。使用miRNA治疗方法能有效降脂，并且副作用较少。miRNA-122和miRNA-33a/b的慢性抑制作用分别有助于改变血脂水平并减少副作用。载脂蛋白B是LDL颗粒及相关动脉粥样硬化脂蛋白的重要组成部分，ASOs靶向作用于载脂蛋白B。米泊美生钠注射剂目前已被批准用于治疗家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia，FH)及脂代谢遗传性疾病[20-22]。Kynamro主要在肝脏积累，使载脂蛋白B的mRNA沉默，从而降低载脂蛋白B和LDL的剂量和时间依赖性。在FH患者中，Kynamro治疗使LDL水平降低25%～50%，降脂效果明显。长期使用Kynamro等药物的副作用包括注射部位反应、肝毒性和肝脂肪变性。在血脂异常、胰岛素抵抗和代谢综合征患者中发现载脂蛋白CⅢ水平升高，而载脂蛋白CⅢ是极低密度脂蛋白的组成部分，ASOs可靶向作用于载脂蛋白CⅢ，抑制脂蛋白、肝脂肪酶，降低肝脏对甘油三酯的摄取，可用于高甘油三酯血症的治疗。

3.3 miRNA治疗与动脉粥样硬化 动脉粥样硬化是慢性炎性疾病，可引起威胁性命的并发症如心肌梗死和卒中，其往往始于内皮功能障碍，后期脂肪酸化合物、胆固醇、钙及其他物质逐渐在动脉内积累，最终形成斑块。miRNA-33a内含子位于人类固醇调节元件结合蛋白2上，可控制胆固醇的吸收与合成[14]。miRNA-33拮抗剂通过20F/MOE修饰基因沉默治疗，使高密度脂蛋白水平升高，血浆极低密度脂蛋白水平降低，甘油三酯水平降低[23]。miRNA及其关键调节酶Dicer酶在内皮细胞上发挥主要功能。敲除Dicer酶诱导的miRNA(let-7、miRNA-21、miRNA-126、miRNA-221、miRNA-222)可导致受损的内皮细胞增殖，炎性趋化因子和细胞因子增多[24]。不同的miRNA在斑块的进程中有不同的作用，miRNA的失调对斑块不稳定、破裂起着重要作用[25-26]。内皮细胞特异性miRNA-126独特的腺病毒载体(adenoviral，Ad)编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白 p27kipl(p27)并与成熟miRNA-126-3p链互补的靶序列末端结合(Ad-p27-126TS)。Ad-p27-126TS转导的动脉球囊损伤模型外源性P27过度表达，证实了Ad-p27-126TS具有保护内皮细胞增殖功能[27]。Santulli等[27]发现Ad-P27-126TS治疗的动物在治疗2～4周后再狭窄水平降低，出现完整再内皮化，表明以miRNA为基础的方式可以抑制血管平滑肌细胞增殖，从而防止再狭窄，也可以选择性地促进内皮恢复和保护内皮功能。Bonauer等[28]发现心肌梗死模型小鼠在全身应用针对miRNA-92a的微小RNA拮抗剂后，血管生长增强，受损的组织得到恢复，表明抗-miRNA-92a拮抗剂可诱导抗动脉粥样硬化的效果及阻断内皮细胞的损伤。

4 小 结

miRNA作为调控因子为预防和治疗CHD提供了新的作用靶点，其治疗方法的研究有助于在分子水平上预防和治疗CHD。然而，目前基于miRNA功能的治疗方法如miRNA海绵和miRNAs拮抗剂在心血管领域中还未直接应用于临床，仍面临许多挑战，如药物器官靶向性及潜在的毒副作用等。但是随着基因技术研究的逐渐深入，靶向miRNA的药物在该领域将有更广阔的临床前景。

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梁宝今(1988～)，女，在读硕士研究生，研究方向：冠状动脉粥样硬化性疾病的防治。

梁涛(1965～)，男，硕士，硕士生导师，研究方向：冠状动脉粥样硬化性疾病的防治，E-mail：liangtao655188@163.com。

R 541.4

A

0253-4304(2016)02-0243-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.28

2015-09-08

2015-12-21)