弓形虫致密颗粒蛋白研究进展

王英贺，曹利利，姚新华，苑淑贤，郭衍冰，宫鹏涛，丁　鹤，董　航，魏　峰

(1.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130118；2.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春 130062；3.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春 130062)



文献综述

弓形虫致密颗粒蛋白研究进展

王英贺1,2，曹利利2，姚新华2，苑淑贤2，郭衍冰2，宫鹏涛3，丁鹤3，董航2，魏峰1*

(1.吉林农业大学生命科学学院，吉林长春 130118；2.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春 130062；3.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春 130062)

弓形虫是一种胞内寄生性原虫，由其引发的人兽共患病给公共卫生安全带来了威胁。弓形虫致密颗粒蛋白是弓形虫致密颗粒细胞器分泌的一类免疫活性蛋白，与虫体在细胞内寄生、发育密切相关，是重要的弓形虫疫苗候选抗原分子。论文将近年来在致密颗粒蛋白方面的研究发现和进展进行阐述，为今后的深入研究提供参考。

弓形虫；致密颗粒蛋白；免疫活性蛋白

弓形虫(Toxoplasmagondii)为原生动物门、孢子虫纲、真球虫目、肉孢子虫科、弓形虫属，1908年由法国学者Nicolle和Manceaux在啮齿动物肝脏和脾脏细胞中发现[1]。弓形虫是一种专性寄生在多种哺乳动物有核细胞内的机会性致病原虫，其生活史复杂，呈世界性分布[2]。由弓形虫引发的疾病给人类的健康以及畜牧生产带来的危害极大[3]，我国已于1999年将其列为二类动物疫病[4]，世界动物卫生组织(OIE)将其列为多种动物共患传染病。弓形虫抗原蛋白种类多，但是较为重要的为膜表面蛋白(surface antigen,SAGs)、微线体蛋白(microneme proteins,MICs)、棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)和致密颗粒蛋白(dense granules antigen,GRAs)，弓形虫能侵入宿主细胞并在细胞内生长繁殖离不开这些蛋白的相互作用。近年来研究表明GRAs是保证弓形虫在宿主细胞生长发育必不可少的蛋白， 同时也是抗弓形虫病的疫苗候选分子。GRAs是由致密颗粒细胞器分泌的一类免疫活性蛋白且均为分泌性抗原，不在入侵过程中起作用，在侵入宿主细胞20 min左右其分泌量达到高峰。当GRAs被分泌入纳虫空泡(parasitophorous vacuode，PV)后，大部分蛋白均结合于纳虫泡膜(parasitophorous vacuode membrane，PVM)上。GRAs可以抵抗宿主细胞溶酶体对弓形虫进行的攻击，保证了弓形虫在宿主细胞内的生长和发育，同时因其具有较强的免疫原性，在弓形虫病诊断与检测中有重要作用。本文将近年来对致密颗粒蛋白的研究发现和进展做一综述，希望为今后的相关研究提供参考。

1　弓形虫致密颗粒蛋白的发现和命名

20世纪60年代，通过透射电子显微镜观察弓形虫细胞器内部时，发现的直径约为200 nm的致密小体，这类致密小体的数量因弓形虫所处的不同阶段而有所不同，其中在弓形虫的速殖子阶段最为普遍。随着越来越多的特征蛋白被发现，1991年Sibley等[5]提出了刚地弓形虫基因和蛋白的统一命名法，该命名法起源于酵母。

2　弓形虫入侵宿主的过程

通过研发现弓形虫入侵宿主细胞的机制相对保守，弓形虫黏附并侵入宿主细胞主要是通过微线体、棒状体和致密颗粒等的协同作用。当弓形虫速殖子顶端与宿主细胞表面接触时，弓形虫顶端的亚细胞器分泌MICs和ROPs来对宿主细胞膜上的受体进行分析识别后黏附于宿主细胞膜。在与宿主细胞之间的连接处，虫体依靠其原生质膜下的“肌动蛋白-肌球蛋白”的运动，使宿主细胞膜内陷，虫体挤过连接区，进入宿主细胞内部。入侵后虫体释放ROPs和GRAs，此两种蛋白通过联合作用形成PV将虫体包裹以防止被宿主细胞清除。寄生在宿主细胞内的虫体通过从宿主细胞获取营养物质在PV内生长、发育、分裂并繁殖，最终破出宿主细胞，形成的新速殖子则又开始新一轮的入侵。

3　弓形虫致密颗粒蛋白的特点及其研究现状

GRAs的免疫原性较高，同时也是构成弓形虫缓殖子囊壁和弓形虫速殖子PVM的重要组分，现已报道的GRAs有21种，其中包括2个三磷酸核苷酸水解酶和2个蛋白酶抑制剂。目前GRA1、GRA2、GRA3、GRA4、GRA6、GRA7及GRA15研究较多[6]，现将常见的致密颗粒蛋白的研究现状总结归纳如下。

3.1GRA1

GRA1又称P24，为断裂基因，基因序列全长573 bp，内含子约135 bp[7]，蛋白约为24 ku，有2个钙离子结构域，主要参与修饰并调理PV结构，1989年Delauw等[8]首次完成了GRA1的构建并报道了GRA1基因的生物学特性。弓形虫入侵宿主细胞后，GRA1被分泌入PV管腔作为静脉与膜质管状网络相关联的可溶性蛋白，具有激活以及稳定PV网状结构的功能。GRA1具有较强的免疫原性，在各期均可表达，可作为致密颗粒蛋白的标记基因。谢荣华[9]通过GRA1蛋白与匹多莫德的联合使用，成功刺激机体使宿主细胞产生了较高的细胞与体液免疫。孙玲[10]利用GRA1/MIC6基因对感染弓形虫的小鼠进行免疫保护性进行研究，结果表明用重组蛋白免疫小鼠，小鼠血清IFN-γ和IL-2细胞因子水平与对照组存在显著的差异，且用重组蛋白免疫组的小鼠存活率也得到了提高。

3.2GRA2

GRA2又称P28，基因序列全长1.3 kb，内含子约241 bp，蛋白约28.5 ku。成熟的mRNA长约1.1 kb，可翻译的产物多肽由185个氨基酸组成(含3个α螺旋的两性区域)，无跨膜结构域。GRA2可与GRA4、GRA6在PVM上结合并形成多聚复合体，参与PV内蛋白质以及营养物质的转运。Mercier等通过试验发现，当弓形虫侵入宿主细胞后GRA2对诱导PV表面网络结构的形成意义重大。GRA2在速殖子期和缓殖子期均可存在，是潜在的抗原标记物。GRA2可诱发强烈的抗体反应[11]，属弓形虫毒力相关的基因。有研究调查发现，小鼠被GRA2敲除突变体感染后，其宿存活率大大提高。黄敏君等[12]构建了弓形虫GRA2全基因组蛋白质粒，为研究宿主细胞与GRA2的相互作用起到了重要作用。

3.3GRA3和GRA5

GRA3为单拷贝基因，无内含子，蛋白约30 ku，编码220个氨基酸,其主要存在于弓形虫速殖子期，在体内具有较高的转录水平。GRA3基因的首次克隆研究始于1994年[13],GRA3一直被认为缺少跨膜结构域，其N端分泌的信号序列与其跨膜区相符也使得GRA3以低聚物形式的可溶性蛋白质嵌入PV的脂质双分子层，对于PVM的形成具有重要的作用。GRA5与GRA3相似，都在PVM中被发现，同时即是可溶性蛋白又是疏水性的聚合物。GRA5又称P21，无内含子，基因全长834 bp，编码21 ku的蛋白[14]。弓形虫入侵宿主细胞期间GRA5以可溶性形式被分泌入PV，随后跨膜插入到PVM，同时其N-端投射到宿主细胞质中，而C-末端则保留在液泡腔中。GRA5存在于寄生虫的所有生命阶段，不仅在侵入宿主细胞中扮演重要作用，同时也参与了PV的维护。

3.4GRA4

GRA4为单拷贝基因，不含内含子，基因全长1 536 bp，内含1 038 bp的开放阅读框，并且编码346个氨基酸，1991年Johnson等对弓形虫GRA4首次进行克隆并测序。GRA4与GRA1和GRA2一样存在于PV内的网状结构中，其N-端具有疏水性[15]。GRA4有较强的抗原性，据报道用纯化后的GRA4免疫小鼠，小鼠存活率可达75%。GRA4普遍存在于被急性和慢性弓形虫感染的血清中，有报道称GRA4存在1个T细胞表位和3个以上的B细胞表位可诱发机体产生多种抗体且可诱导机体产生保护性免疫。高洋[16]通过试验成功构建了重组猫疱疹病毒穿梭质粒pBS-TK-SAG1/GRA4，并获得了良好的反应原性。近年来的研究还发现GRA4能够首先诱导小鼠脾细胞产生大量的IFN-γ，其次产生IL-4、IL-10等细胞因子[17]。

3.5GRA6

GRA6以单拷贝形式存在，无内含子，基因序列全长1 632 bp，有一个735 bp的开放阅读框，蛋白分子质量32 ku，编码230个氨基酸[18]。其产物为1个偏向N端的和1个位于中央位置并具有跨膜结构域的疏水区域。当宿主细胞被弓形虫速殖子入侵后，GRA6移动到PV的后部来稳定PV的网络结构。Lecordier等通过试验发现GRA6 N端多肽含有一种抗原表位可被B淋巴细胞识别，而Sun等则通过构建真核表达载体免疫小鼠，发现GRA6可使宿主体内的T细胞增殖。彭武丽等[4]以GRA6为目的基因成功建立了一套快速而又准确的检测弓形虫的实时荧光定量PCR方法。李瑾等[19]则通过对弓形虫GRA6基因的重组表达等研究，为弓形虫病诊断抗原试剂盒的研发奠定了基础。

3.6GRA7

GRA7又称P29，基因序列全长1.3 kb，其分子质量约29 ku，编码236个氨基酸，有2个跨膜结构域。Fisher等和Jacobs等于1998年分别报道了不同虫株的GRA7，并表示GRA7分布于包囊壁中以及弓形虫多个生活史阶段[20]，目前发现该蛋白是唯一一个可以通过亚细胞结构膜连接虫体和宿主细胞的膜内蛋白。以往研究发现GRA7与弓形虫毒力相关并且表达水平很高，有较高的抗原性[21]，可诱导机体主动产生黏膜免疫和全身性免疫，且可刺激机体产生抗体应答。通过免疫荧光显色试验发现速殖子中GRA7分布于PV中，而存在于缓殖子的GRA7则分布在宿主细胞的胞浆中。洪彩玲[22]通过验证GRA7与宿主组分的相互作用时，发现GRA7具有较好的抗原性是一种潜在的诊断弓形虫感染有效的抗原分子，同时也与PV的形成相关。Alaganan A等[23]则发现GRA7效应物与小鼠的急性毒力相关，可以增强免疫相关GTPase的回收利用。

3.7GRA8

GRA8基因全长1 311 bp，含有241 bp的内含子和804 bp的开放阅读框，其分子质量为38 ku，编码267个氨基酸，目前没有发现与GRA8同源的蛋白。GRA8基因是通过弓形虫单克隆抗体MabA3.2对弓形虫cDNA文库进行筛选等方面的研究发现的[24]。Babaie J等[25]还发现GRA8包含1个氨基酸末端信号肽，3个富含脯氨酸的中央区域及1个邻近羧基末端的跨膜结构域。袁仁善等[26]构建了GRA8的原核重组表达质粒，并分析了其不同片段在大肠埃希菌中的表达情况，最终发现纯化后的截短型GRA8具有一定的抗原反应性，这一研究为弓形虫病的诊断奠定了基础。

3.8GRA9、GRA10和GRA12

GRA9有2个内含子，其分子质量大约41 ku，编码318个氨基酸，无跨膜结构域，通过荧光显微镜和电子显微镜观察发现其存在于PVM上。GRA9存在可溶和非可溶两种状态，其主要的生物学功能为维持PV的空间稳定性，以及调节PV网状结构。GRA10分子质量约36 ku，编码364个氨基酸，其氨基酸序列含有一个N末端信号序列，以及2个跨膜结构域，参与调节宿主细胞rRNA的合成。GRA10为可溶性的GRAs可以被分泌到PV中以及弓形虫胞质中[27]。在寄生虫入侵开始后不久,GRA12从虫体前段分泌到PV，然后通过一系列迁移，最后驻留在整个液泡空间，与成熟的膜质纳米管网络相关，GRA12同GRA2及GRA6功能相似[28]。

3.9GRA14

GRA14无内含子，基因全长1 227 bp，Rome M E等[29]于2008年报道了GRA14，该蛋白的跨膜方式与GRA5相反即C端位于弓形虫的细胞膜之外而N端则在PVM内部。陈锐钊等[30]通过对不同宿主和不同地理来源的9株弓形虫虫株GRA14基因的克隆及一系列分析，推导出致密颗粒蛋白GRA14的蛋白二级结构主要通过3个β折叠、6个α螺旋、11个β转角及多个无规卷曲构成。有研究显示GRA14存在于PVM中，有较好的保守性，可作为新型的弓形虫疫苗候选抗原分子。

3.10GRA15

GRA15主要在速殖子期表达，是一种拥有独特功能的多态性分泌蛋白，它不包含任何保守结构域，目前还没有发现与GRA15有同源性的蛋白质。有研究证明GRA15可以很好的诱导CD8+T淋巴细胞所介导的CTL效应[31]。研究还发现GRA15可活化NF-κB信号通路，最终达到干扰小鼠GBP和PVM的相互结合[32]。

4　结语

弓形虫感染可以引起多种病症，不但威胁人类健康，还严重影响着畜牧业的发展。目前国内外科研工作者虽然对弓形虫做了详细研究并取得了一些成绩，但却因为弓形虫宿主范围广，生活史复杂，抗原成分复杂，致病蛋白种类多样，至今仍存在许多亟待解决的问题。GRAs作为虫体在宿主细胞内存活的关键蛋白，以及PV的重要的代谢分泌抗原之一，对于弓形虫病诊断意义重大。因此，深入研究GRAs对弓形虫病的防治具有重要价值。相信随着生物化学与分子生物学等技术的快速发展，越来越多未知种类及功能的弓形虫致密颗粒蛋白将会被发现，会为今后弓形虫病的诊断与治疗提供重要帮助。参考文献：

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Progress on Toxoplasma gondii Dense Granule Proteins

WANG Ying-he1,2，CAO Li-li2，YAO Xin-hua2，YUAN Shu-xian2，GUO Yan-bing2，GONG Peng-tao3，DING He3，DONG Hang3，WEI Feng1

(1.College of life Sciences,Jilin Agricultural University,Changchun,Jilin,130118,China;2.JilinInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,Changchun,Jilin,130062,China;3.CollegeofAnimalScienceandVeterineryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin,130062,China)

Toxoplasmagondiiis an intracellular parasitic protozoa,which caused zoonosis poses a threat to public health and safety.Toxoplasmagondiidense granule protein which is a kind of immune active protein secreted by theToxoplasmagondiidense granule cell is closely related to the parasitism and development of the parasite,so it is candidate antigen ofToxoplasmagondiivaccine.In this paper,the new discovery and progress of the research on the dense granular protein in recent years were reviewed to provide a reference for the in-depth research in the future.

Toxoplasmagondii;dense granule protein;immunoactive protein

2016-02-11

国家科技支撑计划课题(2015BAI07B02)；国家自然科学基金项目(31302076，31472183)；吉林省留学人员科技创新创业项目(2012)；吉林省公益性科研单位基本科研专项社会公益研究项目(2060302)

王英贺(1991-)，女，吉林公主岭人，硕士，主要从事动物生物化学与分子生物学研究。*通讯作者

S852.72

A

1007-5038(2016)08-0075-04