鸡传染性鼻炎疫苗防控研究进展

凌云志，程小果，何福庆，王常伟，陈申秒,2*

(1.山东滨州沃华生物工程有限公司，山东滨州 256600;2.山东博莱威生物技术研究所，山东滨州 256606)



鸡传染性鼻炎疫苗防控研究进展

凌云志1，程小果1，何福庆1，王常伟1，陈申秒1,2*

(1.山东滨州沃华生物工程有限公司，山东滨州 256600;2.山东博莱威生物技术研究所，山东滨州 256606)

鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌(Apg)引起的一种鸡急性上呼吸道传染病，该病主要造成育成鸡生长不良和产蛋鸡产蛋明显下降，并可使肉鸡淘汰率明显升高，造成很大的经济损失。论文从副鸡禽杆菌的主要毒力因子、血清分型和疫苗研究三个方面对鸡传染性鼻炎最新研究进展进行综述，并介绍了疫苗使用效果和研发趋势，对当前鸡传染性鼻炎的防控前景进行了分析。

副鸡禽杆菌；鸡传染性鼻炎；疫苗

鸡传染性鼻炎(Infectious coryza，IC)的病原菌为副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)，旧称为副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagallinarum，Hpg)。1920年首次报道该病后，1931年从疑似鼻炎鸡群中分离到第1株副鸡禽杆菌[1-2]。2005年Blackall P J等[3]根据16 S rRNA碱基序列的同源性及生化特性，将副鸡嗜血杆菌划归为巴氏杆菌科下的一个新属，即禽杆菌属，并将副鸡嗜血杆菌的名称改为副鸡禽杆菌。国内1987年首次分离到第1株Apg，目前该病已广泛流行于国内各养殖区域，特别是对蛋鸡的生产性能造成很大的影响。

1　副鸡禽杆菌的主要毒力因子

血凝素抗原是副鸡禽杆菌的毒力因子之一。研究证明血凝素抗原是决定副鸡嗜血杆菌免疫原性和致病性的关键因素。据报道，C型菌株编码HA抗原决定簇的基因位于hpc5.5这个特定的基因片段上，将其用重组子表达后免疫鸡群，可完全保护C型强毒株的攻击。有研究者报道在副鸡禽杆菌的A型和C型菌株的HA蛋白残基的1 100-1 600位存在一个高变区，分别用此高变区制作的抗血清与该菌的全菌抗原做Western blot进行分析，结果表明与血凝素蛋白的其他区域相比，高变区抗原性最高，且属于特异血清型；用包含高变区的重组蛋白免疫的鸡对同样血清型的副鸡禽杆菌的保护率为83%～100%，含有高变区的重组蛋白的A型和C型副鸡禽杆菌疫苗对发挥疫苗的保护作用至关重要。Yuan-Man Hsu等[4]对来自台湾A9分离株的功能性重组血凝素蛋白(rHagA)进行了免疫原性分析，rHagA 亚单位疫苗免疫保护率可达71%，rHagA是一种温和性的免疫原，也许不是体内的主要血凝素，其血凝活性只针对甲醛固定的血红细胞。我国研究者发现采用原核表达的Apg的重组血凝素抗原可以凝集鸡红细胞，并可诱导产生血凝抑制抗体，但是其作为免疫原，诱导的免疫保护作用不足以抵抗副鸡禽杆菌的攻击；获得的2个具有免疫原性的副鸡禽杆菌免疫优势模拟表位，转化表达后免疫鸡产生的对应抗体分别能与副鸡禽杆菌A型和C型菌株结合，攻毒试验表明免疫鸡获得了部分保护，故鉴定出的副鸡禽杆菌的2个免疫优势模拟表位可作为研制与开发鸡传染性鼻炎新型疫苗的候选表位[5]。2014年，Wang Yi Ping等[6]研究显示，三聚体自转运蛋白HMTp210是副鸡禽杆菌的主要血凝素抗原，在黏附宿主细胞和形成生物膜的过程中起关键作用，这些发现对于进一步阐明副鸡禽杆菌致病机制及研发新型疫苗具有重要作用。

荚膜是存在于细菌的表面结构，是鉴别细菌的依据之一，通过苯酚-硫酸法可以测定副鸡禽杆菌的荚膜多糖含量，结果显示每升菌液可以提取得到荚膜多糖85mg，含量为59.6%，高效液相色谱(HPLC)分析该多糖主要由D葡萄糖、D木糖和L鼠李糖等组成。研究显示使用荚膜多糖和血凝素两种抗原制成的疫苗要比两者单独使用的效果要好，对强毒攻击的保护率可达到80%[7]。

散在质粒含有能够编码与毒力相关的基因。2013年，瑞士学者报道发现了一种新的毒力因子AvxA，它编码副鸡禽杆菌的复合丝氨酸蛋白酶的RTX毒素，对禽的巨噬细胞系HD11有细胞毒性，是一种副鸡禽杆菌所有血清型共有的主要毒力因子[8]。

Apg的毒力因子较复杂，包括HA抗原、荚膜和质粒等。但HA抗原是决定其致病性和免疫原性的关键因素，重组血凝素抗原，HA抗原中存在的高变区、三聚体自转运蛋白或一些优势模拟表位均可成为具有免疫原性的抗原，在阐明副鸡禽杆菌致病机制及研发新型疫苗方面具有重要意义。

2　副鸡禽杆菌的血清型与致病力的相关性

目前，最通用的Apg血清学分型方案仍将其分为A、B、C3型的Page方案。副鸡禽杆菌Page分型方案的核心是血凝抑制试验(HI)，广泛地应用于众多分型方法。先用简单未处理的Apg全菌抗原和醛化鸡红血球做血凝试验(HA)，测定出抗原的HA效价，再分别使用该抗原和A、B、C型Apg全菌制备的高免兔血清与醛化鸡血球做HI试验，鉴定其血清型。但若用简单未处理的Apg全菌抗原测不出HA滴度，可先用透明质酸酶或硫代氰酸钾(KSCN)处理Apg全菌抗原后再测HA滴度，再同法前述HI试验，鉴定其血清型。早期有研究表明某些副鸡禽杆菌分离株存在着致病性的变化，称B型菌株不致病，但是近年来的研究结果显示B型菌株也可以致病[9]。国内研究者选用120只SPF鸡研究了A型、B型和C型3种血清型的致病力，结果除1只鸡(B型)未发病外，119只鸡均呈现典型的鸡传染性鼻炎症状，说明A型、B型和C型副鸡禽杆菌对SPF鸡均有很强的致病力[10]。Zhao Qin等[11]用150只30日龄的普通鸡进行了A型、B型和C型的致病力试验，3株试验菌株中A型和B型菌株毒力相差不大，C型菌株毒力相对较弱，3种血清型导致的临床症状相似，都出现了面部水肿、结膜炎和流出浆液性或黏液性鼻分泌物。当攻毒剂量较小时，发病率较低，表现为部分发病；当攻毒剂量较大时，发病率较高，部分或全部发病。其他研究也表明B型副鸡禽杆菌有较强的致病性[12-13]。

Kume方案是除Page方案之外的另一种Apg血清学分型方案，其可将Apg分为A-1、A-2、A-3、A-4、B-1、C-1、C-2、C-3、C-4共9个血清型，HI试验使用超声波裂解加KSCN处理的抗原。由于Kume血清型与免疫保护的相关性不清楚，且对技术要求较高，该方案未得到广泛应用[14]。2004年，Soriano V E等[15]对9个Kume血清型参考株的毒力进行研究，结果表明不同血清型的Apg具有明显毒力差异，其中C-1型毒力最高，C-4型毒力最低。

随着分子生物学技术的发展，研究者尝试建立分子分型方法，用DNA限制性酶切指纹技术对副鸡禽杆菌的8个代表株进行分型，结果显示来自澳大利亚的8个菌株具有遗传相似性，而14个非澳大利亚株与澳大利亚的菌株不同，且彼此之间也不相同。另有学者采用核糖体分型技术证实了南非分离的NAD非依赖性副鸡禽杆菌是自然克隆。目前国内外研究常采用基于肠道细菌基因间重复序列(ERIC)的PCR技术对Apg分型，用ERIC-PCR技术对副鸡禽杆菌的分型研究证实了不同来源的C-2型菌株具有相同的ERIC谱型。2014年Morales-Erasto V等[16]对来自厄瓜多尔、墨西哥和巴拿马的16个B-1血清型分离株和2个标准株进行了ERIC-PCR分型，获得了10个可区分的ERIC谱型。王雪敏等[17]将ERIC-PCR和RAPD-PCR两种技术结合起来，分析了10个国际标准株，血清C型疫苗株及4个国内分离株，划分出可聚为4类的11个谱型，并可与现有分型方法中的不同亚型一一对应，说明该方法能够区分不同血清亚型。

Apg分型技术的不断发展和成熟显示，目前广泛认可的Page方案中A、B、C 3个血清型存在有差异的致病力，且不同血清型之间抗原交叉较低，故对当地流行的血清型须做好流行病学调查，进行有针对性的防疫。

3　鸡传染性鼻炎疫苗研究进展

2005年Fernández R P等[18]研究了副鸡禽杆菌的二价(A-1和C-1)、三价(A-1、B-1和C-2灭活疫苗对流行株的保护力。结果显示，二价灭活苗可以对A-1、A-2和C-2产生明显保护作用并诱导产生较强的HI抗体，但是不能保护鸡免受B-1型的感染发病；而三价疫苗则能够对上述4种流行株提供足够的保护力。同年我国研究者比较了国内应用的5种A、C型二价灭活疫苗的免疫效力，结果表明其中的3家疫苗对A、C型菌保护效力较好，而另外2家产品效力较差，但是所有5种A、C型二价灭活疫苗免疫后均不能对B型菌的攻击提供保护，与Fernández R P等[19]的研究结果一致。

研究者利用Page A、B、C型副鸡禽杆菌菌株研制鸡传染性鼻炎(IC)三价灭活疫苗，用6批IC疫苗进行了单剂量多次接种和大剂量单次接种的安全性试验。结果表明，IC三价灭活疫苗安全无副作用；分别用普通鸡和SPF鸡进行3批疫苗的免疫效力试验，结果对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥80%；42日龄首免商品鸡，110日龄二免，二免后9个月对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥80%；用4℃～ 8℃保存1年的3批疫苗进行了SPF鸡的免疫效力试验，结果对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥80%[20]。

鸡传染性鼻炎也可以联合其他疾病病原，如鸡毒支原体、新城疫病毒等制成联苗，可以减少免疫次数，减轻鸡的应激反应，是未来疫苗发展的方向之一。应用鸡副嗜血杆菌国际标准株A型、C型和鸡毒支原体国际标准株制备了抗鸡传染性鼻炎双价和鸡支原体病二联油乳剂灭活疫苗。通过多批次SPF鸡免疫试验，进行了疫苗安全性、抗体产生时间及抗体动态变化规律、免疫维持期、攻毒保护率及临床鸡群的试验。结果表明，接种疫苗后10 d～15 d可相继产生HPG和MG血清抗体；接种6个月内，强毒攻击的免疫保护率为91%～100%，各项试验的指标不低于各自的单苗，具有很好的推广应用价值[21]。据2015年的研究报道，有学者利用Page A、B、C型副鸡禽杆菌和新城疫病毒La Sota株研制了鸡传染性鼻炎(三价)和新城疫二联油乳剂灭活疫苗，并进行了安全性试验、SPF鸡的免疫力试验、商品鸡的免疫持续期试验和疫苗的保存期试验。结果表明该二联疫苗安全有效，二免后的商品鸡对鸡传染性鼻炎保护率在70%以上，对新城疫病毒强毒可100%保护[22]。

应用基因工程表达免疫原性优良的蛋白来研发疫苗是一个非常有前景的方向。据2013年的报道，日本学者Ryuichi S将A型和C型副鸡禽杆菌的外膜蛋白的血清特异性区域用大肠埃希菌表达融合肽，用含有该融合肽的疫苗接种35日龄SPF鸡后用大剂量的A型菌株和C型菌株攻毒。结果显示，免疫鸡没有表现任何临床症状，对A型和C型的保护力都达到100%，并且接种部位无肿胀等不良反应。目前应用的二价灭活疫苗采用的全菌培养A、C型两种菌株，成本高且程序繁琐，该重组融合肽疫苗只需要培养一种菌株，并且在低浓度抗原的情况下能提供高效的保护力，是一种有效、安全、经济的疫苗[23]。最新研究表明，根据副鸡禽杆菌外膜蛋白GcbG研制的亚单位疫苗对血清A型保护率优于全菌灭活疫苗，可达90%，有望成为新的亚单位疫苗候选抗原[24]。

对当地流行的血清型必须做好流行病学调查，疫苗菌株和流行株血清型的良好匹配，是疫苗产生有效保护的前提[25]。传统的鼻炎二价或三价灭活疫苗仍是目前使用的最广泛的类型[26]，保护效果因菌株是否对型及免疫原性的好坏而存在差异，全价(A、B、C三价)且免疫原性良好的流行菌株疫苗保护效果明显要好。联苗及基因工程苗是今后疫苗的发展方向，可达到安全、高效的保护效果。

4　鸡传染性鼻炎防控技术发展前景

鸡传染性鼻炎的特征是发病率高而病死率低，大量动物攻毒试验和临床病例也印证了该观点[27]。在试验过程中，所用菌株代次的高低，试验所用鸡是否为SPF鸡，接种途径等因素会对结果有一定影响。副鸡禽杆菌A、B、C 3种血清型的致病性都很高，可以对鸡场造成严重损失，故疫苗的选择要结合当地菌株的流行情况而定，全价(A、B、C三价)且免疫原性良好的流行菌株疫苗因其对型良好且全面而呈现较好的保护效果。

通过分离菌株的水平传播试验结果表明，引起鸡场Apg的水平传播和鸡传染性鼻炎的反复发作与饲养管理诸如饲养密度、通风换气、饲养模式等因素有很大的关系[28]。在实际养殖过程中，鸡的日龄、品种对临床表现也有影响，饲养环境恶劣、营养不良和寄生虫等并发因素可增加该病的严重程度并延长病程；其他疾病，如传染性喉气管炎、传染性支气管炎、禽痘、巴氏杆菌病和鸡毒支原体的继发均可使鸡传染性鼻炎的病情加重，引起死亡率的增加以及病程延长[29]。

在临床上综合防控鸡传染性鼻炎，首先，要抓好饲养管理，尽量控制好可引发鸡群发病的各种环境因素，降低各种不利因子对鸡群的应激和危害；其次，要做好鸡群疾病的综合性防控体系，将本场本地的各种流行病尽量做到全面细致的防护，降低各种原发性疾病特别是病毒类传染病的发病率，能在很大程度上减少鼻炎等细菌性疾病的继发病例[30]；再次，要做好鼻炎疫苗的选择和布放，在高发地区和鸡群，依据发病规律等提前做好疫苗或结合药物的预防与控制；最后，针对发病鸡群，可结合临床敏感药物，选用适宜的疫苗，采用紧急免疫接种的方式补救防疫，可在一定程度上控制鸡群的发病及伤淘，不失为鸡群鼻炎发病后的最佳防治方案。推荐方案应用如下：需选择水质佐剂的鸡传染性鼻炎灭活疫苗。将临床药敏试验所筛选出pH接近中性或弱碱性的水溶性治疗剂量的敏感抗生素溶解于疫苗中，免疫鸡群后即可起到紧急治疗的作用与效果。该方案的原理如下：敏感的治疗剂量的抗生素会迅速被机体吸收，达到药效浓度，控制鼻炎疫情的进一步发展与蔓延；水性疫苗在鸡体内可快速释放大量抗原，可较快地刺激鸡产生抗体形成坚强保护力，达到稳定抗体后维持一定的作用时间，弥补了药物治疗药效周期短、需反复投药的不足，且免疫应激小，效果发挥快速稳定，紧急治疗的效果确实。值得一提的是，鼻炎疫苗加强免疫后，可获得更持久的保护力，临床保护效果更好，能很好地解决鼻炎反复发作带来的诸多问题，是目前常规疫苗不断创新生产工艺及不断提高内在质量所产生的新用法，在临床上有较好的推广空间。

[1]Beach J R.The diagnosis,therapeutic and prophylaxis of chicken-pox (contagious epithelioma) of fowls [J].Am Vet Med Assoc,1920,58:301-312.

[2]De Blieck L.A haemoglobinophilic bacterim as the cause of contagious cattarh of the fowl (coryza infection gallinarum) [J].Vet J,1932,88:9-13.

[3]Blackall P J,Christensen H,Beckenham T,et al.Reclassification ofPasteurellagallinarum,[Haemophilusparagallinarum],PasteurellaaviumandPasteurellavolantiumasAvibacteriumgallinarumgen.nov.,comb.nov.,Avibacteriumparagallinarumcomb.nov.,Avibacteriumaviumcomb.nov.andAvibacteriumvolantiumcomb.nov [J].Int J Syst Evol Microbiol，2005,55(Pt 1):353-362.

[4]Hsu Yuan Man,Happy K Shieh b,Chen Wei Hao,et al.Immunogenicity and haemagglutination of recombinantAvibacteriumparagallinarumHagA [J].Vet Microbiol,2007,122(14):280-289.

[5]王宏俊,龚玉梅,高亚萍,等.副鸡禽杆菌抗原表位的筛选与鉴定[J].中国兽医科学,2009,39(07):587-592.

[6]Wang Yi Ping,Hsieh Ming Kun,Tan Duen Huey.The haemagglutinin ofAvibacteriumparagallinarumis a trimeric autotransporter adhesin that confers haemagglutination,cell adherence and biofilm formation activities [J].Vet Microbiol,2014,174 (13):474-482.

[7]路迎迎.副鸡禽杆菌荚膜多糖提取分析及免疫原性研究[D].河北邯郸：河北工程大学， 2014.

[8]Kung E,Frey J.AvxA,a composite serine-protease-RTX toxin ofAvibacteriumparagallinarum[J].Vet Microbiol，2013,163 (29):290-298

[9]路迎迎,路明华,陈小玲,等.B型副鸡禽杆菌安徽株的分离与鉴定[J].动物医学进展,2014,35(1):122-125.

[10]龚玉梅,张培君,孙惠玲,等.三型副鸡禽杆菌对SPF鸡的致病力试验[J].动物医学进展,2011,32(02):33-36.

[11]Zhao Qin,Sun Ya ni ,Zhang Xing xiao et al.Evaluation of two experimental infection models forAvibacteriumparagallinarum[J].Vet Microbiol,2010,141 (34):68-72.

[12]张培君， 苗得园， 龚玉梅,等.B型副鸡嗜血杆菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报，2003， 25(1):59-61.

[13]姚东璧,李复煌,谢三磊,等.副鸡禽杆菌3个血清型参考菌株生长曲线的测定和比较[J].动物医学进展,2014,35(7):43-46.

[14]Kume K,Sawata A,Nakai T et al.Serological classification ofHaemophilusparagallinarumwith a hemagglutinin system[J].J Clin Microbiol,1983,17:958-964.

[15]Soriano V E，Lonqinos G M.Virulence of the nine serovar reference strains ofHaemophilusparagallinarum[J].Avian Dis,2004,48(4):886-889.

[16]Morales-Erasto V,Fernández-Rosas P,Negrete-Abascal E,et al.Genotyping,pathogenicity,and immunogenicity ofAvibacteriumparagallinarumserovar B-1 isolates from the Americas.[J].Avian Dis,2014,58(2):293-296.

[17]王雪敏， 吕学泽， 梁玉荣,等.副鸡禽杆菌的指纹图谱分型[J].中国兽医科学， 2011， 41(11):1140-1143.

[18]Fernández R P,Colíndres H L,Velásquez Q E,et al.Protection conferred by bivalent and trivalent infectious coryza bacterins against prevalent serovars ofAvibacterium(Haemophilus)paragallinarumin Mexico [J].Avian Dis,2005,49(4):585-587.

[19]孙惠玲， 苗得园， 陈晓峰,等.五种市售鸡传染性鼻炎灭活疫苗免疫效力比较[J].中国预防兽医学报，2005，27(6):544-548.

[20]Gong Y,Zhang P,Wang H,et al.Safety and efficacy studies on trivalent inactivated vaccines against infectious coryza [J].Vet Immunol Immunopathol,2014,158(1-2):3-7.

[21]赵化民， 周方红，曲立新,等.鸡支原体，鸡传染性鼻炎双价二联油乳剂灭活疫苗的研究[J].中国预防兽医学报，1999，21(3):187-190.

[22]龚玉梅， 张培君， 朱文革,等.鸡传染性鼻炎(三价)和新城疫二联灭活疫苗的研究[J].动物医学进展， 2015，36 (1):40-44.

[23]Ryuichi S,Susumu B,Toshihiro U,et al.Development of a recombinant vaccine against infectious coryza in chickens [J].Res Vet Sci,2013,94(3):504-509.

[24]赵成全,路明华,李淑芳,等.副鸡禽杆菌外膜蛋白GcbG的表达及免疫效果研究[J].中国兽医科学,2016，46(1):58-63.

[25]乔宏兴,索江华,边传周,等.鸡传染性鼻炎氢氧化铝佐剂灭活苗的制备及免疫试验[J].动物医学进展,2014，35(6):157-159.

[26]杨国良,梁爽,张洪,等.副鸡禽杆菌发酵培养工艺研究[J].中国畜牧兽医,2016，43(1):267-273.

[27]Boucher C E,Theron C W,Hitzeroth A C,et al.Regulation of chicken immunity-related genes and host response profiles againstAvibacteriumparagallinarumpathogen challenge [J].Vet Immunol Immunopathol,2015,167(1-2):70-74.

[28]Boucher C E,Theron C W,Jansen A C,et al.Transcriptional profiling of chicken immunity-related genes during infection withAvibacteriumparagallinarum[J].Vet Immunol Immunopathol,2014,158(s 3-4):135-142.

[29]Blackall P J,Turni C.Understanding the virulence ofHaemophilusparasuis[J].Vet J,2013,198(3):549-550.

[30]李杰峰,谢春伏,李庆锁,等.基于万方数据库的新城疫混合感染文献分析[J].动物医学进展,2014，35(3):120-124.

Progress on Prevention and Control of Infectious Coryza by Vaccination

LING Yun-zhi1,CHENG Xiao-guo1,HE Fu-qing1,WANG Chang-wei1,CHEN Shen-miao1,2

(1.Shandong Binzhou Wohua Biotech Co.,Ltd.,Binzhou， Shandong，256600,China;2.ShandongBinzhouBolaiweiBiologicalTechnologyInstitute,Binzhou，Shandong，256606,China)

Infectious coryza is an acute upper respiratory disease of chickens caused byAvibacteriumparagallinarum,and this infection causes economic losses due to an increased culling rate in broilers and significant reduction of egg production in layers and breeding fowl.This article summarized research progress on virulence factor,serological classification and vaccination ofAvibacteriumparagallinarum,and introduced the effect of vaccination and the development trend,and put forward new ideas for the prevention and control of the infectious coryza.

Avibacteriumparagallinarum; infectious coryza; vaccine

2016-01-21

滨州市科技发展计划项目(2012ZC0911)

凌云志(1990-)，男，山东滨州人，硕士，主要从事动物传染病的防控研究。*通讯作者

S855.12

A

1007-5038(2016)08-0094-05