水牛四种主要细菌性传染病研究概况

杜　丽，王凤阳

(海南大学农学院/海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室/海口市动物基因工程重点实验室，海南海口 570228)



专论与讲座

水牛四种主要细菌性传染病研究概况

杜丽，王凤阳*

(海南大学农学院/海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室/海口市动物基因工程重点实验室，海南海口 570228)

随着国内水牛养殖集约化程度的提高，对于水牛细菌性传染病研究水平提升的需求日益迫切。乳房炎、布鲁菌病、结核病和李氏杆菌病是水牛4种主要的细菌性传染病，国内相关研究报道较少。血清学调查可以为水牛细菌性传染病的流行提供基础数据；病原分型可以为水牛细菌性传染病的诊断提供重要依据；诊断技术的准确性和特异性研究可以提高水牛细菌性传染病的诊断水平。基于此，对国外关于乳房炎、布鲁菌病、结核病和李氏杆菌病等水牛细菌病在血清学调查、病原分型、诊断技术等方面的研究进展进行了综述，旨在为提高我国水牛细菌性传染病的研究水平提供参考。

水牛；细菌性传染病；诊断

作为联合国粮农组织(FAO)认定的最具开发潜力和开发价值的家畜，水牛分为河流型水牛和沼泽型水牛，河流型水牛染色体核型为2n=50，沼泽型水牛染色体核型为2n=48。河流型水牛主要分布于印度、巴基斯坦、埃及和意大利等国。我国的水牛品种属于沼泽型水牛[1]。近年来，水牛正由奶、肉、役3种用途的家畜向奶用家畜转变。从水牛养殖的数量、规模及水牛奶的产量来看，印度和巴基斯坦分居世界第一和第二。在水牛奶的加工领域，意大利、英国等国家也开展了卓有成效的工作。

我国现存栏水牛2 000多万头， 但由于产业化程度低，技术支撑体系薄弱，在水牛奶的产量和高档乳制品的研发方面，与印度、巴基斯坦及意大利等国还存在一定的差距。其中，对于水牛细菌性传染病研究滞后影响奶水牛产业发展这一问题尤其需要引起重视。水牛的主要细菌性疫病包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)引起的乳房炎、布鲁菌病、结核病和李氏杆菌病等。本文就水牛的几种主要细菌性传染病的研究进展进行综述。

1　细菌性乳房炎

奶牛乳房炎症状为乳房实质、间质的炎症。病因多由机械性刺激、金黄色葡萄球菌等病原微生物侵入及化学物理性损伤所致，包括临床型和亚临床型[2-3]。巴西的Marta Aires-de-Sousa M等从亚临床型乳房炎的水牛分离到金黄色葡萄球菌(S.aureus)[4]。印度Sentitula Yadav B R等[5]应用加利福尼亚乳腺炎试验 (california mastitis test，CMT) 对82头摩拉水牛进行检测，结果发现，57头为乳房炎阳性，且分离到金黄色葡萄球菌。为了准确诊断水牛亚临床乳房炎，鉴定主要病原体，评价细菌的抗生素抗性，Preethirani P L 等[6]应用体细胞计数、导电性、CMT、溴麝香草酚蓝试验和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶试验对来自亚临床乳房炎水牛的奶样进行了分析。与体细胞计数这一金标准相比，CMT 的检测效果较好，如果将2种方法进行结合，效果最好。生化分析和PCR分析结果表明，凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negativeStaphylococcus，CNS)所占比例为64.8%,金黄色葡萄球菌所占比例为7.3%。大部分病原菌具有多种抗生素抗性，尤其是β内酰胺类。

Oliveira A A 等[7]用加有5%去纤维蛋白羊血的哥伦比亚琼脂对来自137头水牛的奶样进行培养，结果发现，36头(10.8%) 为葡萄球菌阳性，其中83.3%为CNS，11.1%为凝固酶阳性葡萄球菌(coagulase-positiveStaphylococcus，CPS)，5.6% 为CPS+CNS阳性，1%的金黄色葡萄球菌对青霉素和阿莫西林克拉维酸合剂敏感，对氨苄、青霉素、苯唑青霉素有抗性。应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法，El-Ashker M等对埃及代盖赫利耶省临床和亚临床乳房炎的奶牛和水牛奶样中的细菌进行了初步鉴定。在对葡萄球菌进行16 S rRNA 基因序列分析和微点阵的进一步微点阵分析，结果5.6%的奶样中发现金黄色葡萄球菌，其中24.5% (12/49) 为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus,MRSA)[8]。

2　布鲁菌病

2002年，印度Renukaradhya G J 等[9]利用研制的检测血清和奶样的ELISA 试剂盒，开展了覆盖几个邦的布鲁菌病流行病学调查。基于获取的大样本调查数据发现，3%的水牛为布鲁菌病阳性，造成的经济损失巨大。针对该状况，Renukaradhya G J 等建议通过实施免疫接种幼犊的控制措施来弥补布鲁菌病防控计划的缺失，同时提出了旨在解决屠宰人员在发现布鲁菌病阳性后廉价抛售水牛禁令执行过程中一些问题的牛布鲁菌病控制方案(bovine brucellosis progressive control programme，BBPCP)。巴基斯坦Ali S等设计了针对B.abortus、B.melitensis、B.ovis和B.suis的布鲁菌种特异的引物，对来自血清学阳性的水牛样本，如流产胎儿、阴道拭子等，进行PCR 扩增，首次发现了水牛生物Ⅰ型B.abortus的流行[10]。Tittarelli M等[11]以平滑型脂多糖作为包被抗原，建立了间接 ELISA 方法，可以对来自水牛奶样的布鲁菌抗体进行检测，并且分离到了生物I 型B.abortus。

应用常规的诊断技术不能检测到RB51 疫苗株诱导的抗体，为了建立一种能够区分感染动物和免疫动物的特异性诊断技术， Tittarelli M 等[12]将基于特异性RB51 抗原的补体结合反应(complement fixation test，CFT)(RB51-CFT)与布鲁菌素皮试相结合，应用于水牛的RB51 疫苗免疫的检测。应用CFT检测了来自意大利萨莱诺省全部为虎红试验(rose bengal test，RBT) 阴性的127头水牛的抗布鲁菌的特异性抗体。在第1次检测中，71头水牛 (56%) 产生抗RB51 疫苗株的RB51 抗原特异性的CFT抗体;在RB51布鲁菌素皮内接种后11 d，进行第2次血清样本检测，104头水牛(82%) 为阳性。 107头水牛(84%)在至少1次样本检测中为RB51-CFT阳性，111头水牛(87%)为布鲁菌素皮试阳性。3次平行试验的分析结果表明，119头水牛(94%) 在至少1次检测中为阳性。这些数据表明， RB51-CFT和RB51布鲁菌素皮试的联合使用，可能是一种检测水牛RB51疫苗免疫的有效方法。

利用基于ELISA原理的IDEXX布鲁菌病血清抗体试剂盒，Gorsich EE等对来自南非克鲁格国家公园的 258头水牛的571 份血清样本进行B.abortus的检测， 并分析了其敏感性和特异性。首先，将RBT和CFT 2种测试均为阳性或均为阴性的样本定义为假定金标准，应用ROC分析，假定金标准，最大化敏感性和特异性的临界值标准，确定了ELISA的临界值， 利用贝叶斯推理与潜类分析估计了3种检测方法的敏感性和特异性。结果表明，ELISA 的敏感性估计为0.928， 特异性估计为0.870;RBT的敏感性为0.986，RBT和CFT的特异性分别达到0.992和0.998，从而说明，没有单一的血清学测试方法能够做到完美。在调整临界值之后，IDEXX布鲁菌病血清抗体检测可能是克鲁格国家公园非洲水牛布鲁菌病检测的另外一种有价值的方法[13]。

Martínez D 等[14]对来自水牛流产胎儿的布鲁菌分离物进行了基于表型和基因型的鉴定，表型鉴定包括二氧化碳需求，硫化氢试验， 硫堇与碱性品红敏感性试验等，基因型鉴定包括扩增bcsp31、OMP2ab和eri，以及进行B.abortus、B.melitensis、B.ovis和B.suis种特异的IS711染色体定位，即AMOS-PCR。结果表明，分离物的表型与阿根廷牛最流行的生物Ⅰ型B.abortus和目前水牛的19疫苗株不同，基因型鉴定结果支持表型分析结果，OMP2ab 基因序列与生物5型B.abortus或B.melitensis相同，AMOS-PCR观察到1条1 700 bp的条带，与生物Ⅰ型B.abortus(498 bp) 和B.melitensis(731 bp)不同，从而证实了该分离物为生物5型B.abortus。 这也是从美洲水牛分离到生物5 型B.abortus的首次报道。

为了评估巴西帕拉州B.abortus引起的水牛布鲁菌病的流行和可能的影响因子，da Silva J B等[15]对来自于3917份怀孕和非怀孕的母牛血清样本进行了检测，其中2 809份来自于马拉若岛，1 108份来自于大陆。缓冲酸化平板抗原(BAPA)筛选试验结果表明，布鲁菌病阳性率为4.8% (188/3 917)， 2-巯基乙醇 (2-ME) 阳性验证试验高达95.7% (180/188)。 大陆动物的的布鲁菌病流行为马拉若岛动物流行率的4.17 倍。繁殖状态显著影响布鲁菌病的血清学流行(P<0.05)，怀孕母牛更为易感。这些数据表明，在拥有最大水牛群体的巴西，布鲁菌病感染非常普遍，并且该病对公共卫生和水牛生产造成了严重威胁。

3　结核病

在亚洲，尼泊尔Jha V C 等[16]从单颈结核菌素皮内注射试验 (single intradermal cervical tuberculin，SICT) 阳性水牛的奶样和粪样中分离到牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis)；在1999 年到 2006年间，Le Roex N 等[17]应用SCIT对南非的4 733 头水牛进行了结核病检测，结果发现，阳性率从2.3% 到 54.7%不等。2008年-2013年，Caron A 等[18]应用卫星全球定位系统(GPS)和无线电项圈等手段，对非洲跨界保护区接近成年的母水牛长距离的迁徙进行了跟踪监测，结果发现，结核病可以在不同的水牛群体间传播。

Khattak I 等[19]应用比较颈皮内注射结核菌素试验(comparative cervical intradermal tuberculin test，CCIT) 方法对巴基斯坦白沙瓦地区556头黄牛和水牛的牛结核病 (Bovine tuberculosis，bTB)进行了检测，5.75% (3.9%～8.0%) 为阳性，老龄动物的阳性率高于青年动物(P<0.01)，同时开展的关于社会人口学状态、动物特性、管理等影响因素的畜主问卷调查结果发现，畜主对于TB 由动物传播到人及TB的症状了解的非常少，只有3.6%的农场主能够比较准确的描述主要的临床症状。Albernaz T T等[20]对来自巴西帕拉州1 140头水牛进行了检测,4.65% (53/1 140)为CCT检测阳性,2.98% (34/1 140) 无结论,92.36% (1 053/1 140) 为CCT检测阴性,在168头被屠宰动物中,33头为CCT检测阳性,18头为无结论,117头为CCT检测阴性,组织病理学加细菌培养结果表明，发病率为4.16%。这些结果说明,CCT检测能够获得满意的检测效果。

除了SICT，检测γ干扰素(IFN-γ) 释放的BOVIGAM(®) 1G也是一种常用的牛结核病诊断方法。为了获得最高敏感度的测试方法，南非的van der Heijden EM 等对基于细胞介导的免疫测试(CMI-)和基于体液免疫的测试方法进行了比较。2013年bTB SICTT测试结果表明，SICTT阳性率为13/35，1头无检测结论。应用基于CMI的免疫测试[BOVIGAM(®) 1G (B1G)和BOVIGAM(®) 2G (B2G)]及血清学检测 (IDEXX TB ELISA) 进行进一步检测，并对13 头阳性牛和1头无检测结论的牛进行宰后检测，以确定bTB。结果发现，在8/14(57.1%) 中存在bTB的损伤特征，并根据肉芽肿损伤SICTT阳性动物数量的比例计算阳性率(相对阳性率)。比较结果表明，B1G 测试方法的敏感性最高 (100%;8/8)，B2G assay次之 (75%;6/8) ，IDEXX TB ELISA最低 (37.5%;3/8)。在21头 SICTT 阴性水牛中，7头表现为B2G 或 IDEXX TB ELISA阳性反应。这些数据说明，BOVIGAM(®) IFN-γ 检测的效果最好[21]。

IFN-γ 释放检测基于病原起源的肽抗原，敏感性欠佳。Goosen W J 等[22]以抗原依赖的IFN-γ诱导蛋白-10 9(IFN-γ-induced protein 10，IP-10)释放检测替代IFN-γ的检测。 应用Bovigam PC-EC 和 Bovigam PC-HP 检测和改进的 QuantiFERON TB-Gold (mQFT) 方法测定了血浆中的IP-10，检测了水牛结核病。Bovigam阳性水牛的M.bovis抗原比例显著高于Bovigam阴性的动物，以Bovigam 结果为参照，应用ROC曲线确定了诊断相关的IP-10临界值， 比较了基于IP-10 和 IFN-γ mQFT 的测试结果。 以IP-10作为诊断标记物，检测到大量的Bovigam阳性动物。作为抗原识别的敏感标记物，在抗原刺激的全血中测定IP-10能增加非洲水牛常规 IGRAs的敏感性。

在巴基斯坦，结核菌素试验或结核杆菌分离培养是检测结核病的主要手段。为了分析结核杆菌的型，Akhtar F等[23]用PCR对奶牛和水牛的奶样和鼻拭子进行扩增，24.7%的样本呈结核菌素试验阳性，92.5% 的奶样和鼻拭子呈结核杆菌PCR阳性,86.8%为结核杆菌复合群，77.4%为牛分支杆菌。

4　李氏杆菌病

印度Shakuntala I等[24]对来自135头水牛的530份粪、鼻腔、阴道拭子及血样进行了李氏杆菌筛查。单核细胞增生李氏杆菌和其他李氏杆菌的患病率分别达到4.4和7.4%。 用PCR扩增prfA、plcA、hlyA、actA和iap等毒力相关基因，用磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI-PLC)和小鼠与鸡胚接种试验检测其致病性。结果发现，全部单核细胞增生李氏杆菌分离物呈现溶血和hlyA基因阳性，其中1株分离物呈现5个毒力相关基因全部阳性，且在PI-PLC试验和动物毒力试验中呈阳性，其余分离物具有hlyA基因，缺失plcA基因，PI-PLC和动物毒力试验检测结果表明无致病性。从而说明多种毒力相关基因检测结合动物致病性试验可以用于检测病原性单核细胞增生李氏杆菌。

印度Barbuddhe S B等[25]发现，在284份水牛血清样本中，基于李氏杆菌溶血素(listeriolysin O，LLO) 的间接ELISA 检测结果表明，25.35%的样本呈阳性。单核细胞增生李氏杆菌的培养物阳性结果和抗李氏杆菌溶血素(ALLO) 的检测结果无一致性。 奶样、肉样中的病原性单核细胞增生李氏杆菌，以及血清中的抗李氏杆菌溶血素抗体在诊断中值得关注。Chaudhari S P等[26]用3×109个病原性单核细胞增生李氏杆菌口腔感染水牛牛犊，进而分析了ALLO的动力学和单核细胞增生李氏杆菌的回收方式。间接平板ELISA检测结果表明，在感染后7 d～10 d，出现ALLO；在感染后16 d～36 d，出现1个窄峰，之后，ALLO滴度缓慢降低，但仍可以检测到，直至感染后70 d。Dot-ELISA检测结果表明，在感染后5 d～7 d，出现ALLO，滴度高于间接平板ELISA的检测结果。在ALLO出现之初，可以回收低比例的病原，但当ALLO达到峰值时，不能在粪、鼻腔、血样中回收到病原菌。

5　展望

就水牛细菌性传染病的种类而言，除了乳房炎、布鲁菌病、结核病和李氏杆菌病之外，常见的还有链球菌、产气荚膜梭菌等导致的疾病；就水牛细菌性传染病研究的深度，尤其是我国对于水牛细菌性传染病的研究而言，与猪、鸡等动物的细菌性传染病研究相比，还有一定的差距。但毋庸质疑，随着水牛养殖集约化程度和产业化水平的提高，以及相应的对于加强技术支撑体系的迫切需求，国内外对水牛细菌性传染病研究的水平一定会达到新的高度。

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Introduction to Four Kinds of Bacterial Infectious Diseases of Buffalo

DU Li,WANG Feng-yang

(Hainan Key Lab of Tropical Animal Reproduction & Breeding andEpidemicDiseaseResearch,AnimalGeneticEngineeringKeyLabofHaikou,CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Haikou,Hainan,570228,China)

With the buffalo industry development,the research level improvement of the bacterial infectious diseases of buffalo is necessary.Serological survey can provide the basic data for the prevalence of the bacterial infectious diseases of buffaloes;pathogen typing can provide the important basis for the diagnosis of the bacterial infectious diseases of buffalo;the study on the accuracy and specificity of diagnosic can improve the diagnostis level for the bacterial infectious diseases of buffalo.So,the research progress on the serological survey,pathogen typing,and the study on the accuracy and specificity of diagnosis of mastitis,brucellosis,tuberculosis,and listeriosis of buffalo abroad were reviewed.

buffalo;bacterial infectious disease；diagnosis

2016-03-25

国家自然科学基金项目 (31460670)

杜丽(1973-)，女，山西阳高人，教授，主要从事兽医微生物学与免疫学研究。*通讯作者

S855.1；S858.23

A

1007-5038(2016)08-0099-05