DNA羟甲基化在恶性黑素瘤的进展

王丹 杨盛波 黄进华

DNA羟甲基化在恶性黑素瘤的进展

王丹 杨盛波 黄进华

DNA羟甲基化指在TET蛋白酶家族催化下，将5甲基胞嘧啶氧化成5羟甲基胞嘧啶的过程，是DNA主动去甲基化的关键中间步骤，主要通过动态调节DNA甲基化水平，影响基因表达。DNA羟甲基化过程可被TET蛋白、三羧酸循环相关酶、维生素C、微小RNA等多种因素调控。研究发现，和血液系统恶性肿瘤及多种实体肿瘤类似，恶性黑素瘤中同样存在5羟甲基胞嘧啶含量降低，DNA羟甲基化调控因素异常等现象，提示DNA羟甲基化可能与恶性黑素瘤的发生发展及预后等相关。

黑色素瘤；5-甲基胞嘧啶；DNA甲基化；异柠檬酸脱氢酶；DNA羟甲基化

表观遗传学最令人瞩目的研究进展之一，是发现TET（ten-eleven translocation）蛋白可将5甲基胞嘧啶（5mC）氧化成为5羟甲基胞嘧啶（5hmC），该过程即为DNA羟甲基化，可通过动态调节DNA甲基化水平，影响基因表达，参与机体生长发育、自身免疫性疾病及多种恶性肿瘤发生发展等过程。

1 DNA羟甲基化及其调控

1.1 DNA羟甲基化与DNA主动去甲基化：相对于DNA甲基化过程而言，目前对DNA去甲基化机制仍知之甚少。现已知DNA去甲基化方式分为被动去甲基化和主动去甲基化。被动去甲基化过程是指在细胞分裂过程中，因DNA甲基转移酶（DNMT）1活性降低或识别能力有限等原因，导致新分裂生成的细胞无法维持原有的甲基化状态，而导致DNA甲基化程度降低的过程。DNA主动去甲基化过程不依赖于DNA的复制，在酶的催化作用下，以5mC为起始，逐步转化为未甲基化的胞嘧啶（C）。研究发现，哺乳动物中TET蛋白家族在铁离子（Fe2+）及α酮戊二酸（α-KG）存在的条件下，可将5mC氧化为5hmC，实现DNA羟甲基化。目前认为，以DNA羟甲基化为起始的DNA主动去甲基化，可通过以下两种机制实现：①氧化去甲基化途径：5hmC可继续在TET酶作用下，逐步氧化成5氟胞嘧啶（5fC）和5胞嘧啶羧基（5caC），生成的5fC和5caC均可被胸腺嘧啶DNA糖苷酶识别，并进一步激活碱基切除修复机制实现C的生成［1］；②脱氨基去甲基化途径：5hmC可以在活化诱导性胞嘧啶脱氨酶/载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样蛋白的脱氨基作用下转变为5羟甲基尿嘧啶（5hmU），5hmU可在胸腺嘧啶DNA糖苷酶启动的碱基切除修复机制下转变为5胞嘧啶。DNA羟甲基化在机体中发挥作用可能主要通过参与DNA主动去甲基化，从而动态调节5mC水平，最终影响基因表达。一般认为，基因调控序列（尤其是启动子区域）的甲基化可抑制基因转录，反之去甲基化则激活基因转录。其次，DNA羟甲基化可能直接通过5hmC来发挥生物学作用。5hmC被喻为继5mC之后、基因组中的“第六类碱基”，是另外一种重要的DNA碱基修饰形式，5hmC可能通过取代5mC而解除后者所行使的生物学功能，或自身招募其他效应蛋白来调节基因转录。

作者单位：410013 长沙，中南大学湘雅三医院皮肤科

1.2 DNA羟甲基化的调控：DNA羟甲基化过程存在复杂的调控机制，目前认为该过程主要可被TET蛋白、异柠檬酸脱氢酶（IDH）、维生素C、miRNA等多种因素调控。TET蛋白在DNA羟甲基化过程中起关键作用。TET蛋白本质上是一种加氧酶，该家族主要包括3个成员：TET1-3，相对应的编码基因分别位于10q21、4q24、2p13，彼此在羧基末端催化结构域享有高度同源性，均可催化5mC进行氧合修饰合成5hmC［2］。TET1和TET3蛋白中均含有一段保守的CXXC（Cys-Xaa-Xaa-Cys）氨基酸序列，该区域对密集的非甲基化CpG双核苷酸有着很强的亲和力，可能是其与DNA结合的关键部位。由于在进化过程中染色体发生倒置，TET2的CXXC保守序列位于基因的上游，已演变成为功能较独立的基因，称之为CXXC4/5，能结合未甲基化的CpG二核苷酸，可直接与TET2的催化域相互作用［3］。研究表明，CXXC4/5可下调TET2蛋白的表达，并呈剂量依赖性，从而减少 5hmC 的生成［4］。

IDH主要包括IDH1、IDH2两个成员，可催化异柠檬酸脱氢生成TET酶的关键辅因子α-KG。恶性肿瘤中IDH突变不仅使TET酶所需辅因子α-KG减少，而且可增加α-KG的同分异构体2-羟基戊二酸的合成［5］。2-羟基戊二酸可竞争性抑制α-KG与靶蛋白的结合，从而干扰依赖α-KG因子的多种酶的活性，包括TET酶及组蛋白去甲基化酶等［6］。最新研究发现，三羧酸循环中另外两种重要的酶琥珀酸脱氢酶和延胡索酸酯酶的突变可通过类似机制干扰TET酶的活性，且通常高甲基化基因更容易被影响［7-8］。此外，近年研究发现，生理水平的维生素C极有可能作为TET蛋白活化的辅因子，促进5mC转化为 5hmC［9］。同样，miR-125b、miR-29b、miR-29c、miR-101和miR-7等多种miRNA可在转录后水平，通过靶向干扰TET mRNA的表达来参与调节DNA 羟甲基化过程［10］。

2 DNA羟甲基化与皮肤恶性黑素瘤

恶性黑素瘤是一种起源于黑素细胞的肿瘤，恶性程度高，易远处转移，在所有皮肤肿瘤中致死率最高。近年研究发现，恶性黑素瘤中存在5hmC含量降低，以及TET蛋白表达降低、IDH突变、维生素C转运异常等导致DNA羟甲基化异常的因素，提示DNA羟甲基化可能与恶性黑素瘤的发生发展及预后密切相关。

2.1 5-hmC与恶性黑素瘤：近年，多位学者运用免疫组化、免疫荧光等方法比较不同病理分期的恶性黑素瘤及良性痣组织切片中5hmC含量，发现恶性黑素瘤中5hmC总体含量较良性痣显著降低［11-13］，并且恶性程度越高，5hmC含量越低［11-12］。研究发现，5hmC总体含量下降的程度与恶性黑素预后相关指标Breslow深度、局部皮肤溃疡以及总体生存率等均有明显的正相关性［11］。淋巴结内良性痣细胞与恶性黑素瘤转移淋巴组织病理表现高度相似，常规HE染色切片常难以鉴别。Lee等［14］应用5hmC特异性免疫组化及免疫荧光比较两者间5hmC含量，发现恶性黑素瘤转移淋巴结组织切片中5hmC水平均明显下降。进一步研究发现，肢端型、黏膜型等常见的黑素瘤疾病亚型中，5hmC含量较Spitz痣等良性痣明显降低。以上研究提示，临床上对皮肤恶性黑素瘤组织切片5hmC含量的测定，可有效地指导早期诊断及预后评估。此外，Uchiyama等［13］还发现，恶性黑素瘤组织无论是否取自光暴露部位，5hmC均表现出相似的低水平，提示5hmC低含量与常见的环境危险因素紫外线可能无明显关联。

Lian等［11］用DNA羟甲基化免疫共沉淀-芯片检测全基因组DNA羟甲基化状态，发现在恶性黑素瘤全基因组中，无论启动子、外显子、内含子还是基因间结构中均可见到5hmC含量较低。KEGG pathway数据库分析显示，羟甲基化差异基因多涉及细胞间粘着连接、Wnt信号通路、肿瘤相关信号通路、黑素合成等信号通路。Gene Ontology数据库显示，羟甲基化异常改变的基因多与基因转录调节、细胞代谢、发育等内容相关。

2.2 TET与恶性黑素瘤：TET2在多种血液系统恶性肿瘤中存在突变，部分TET2突变导致该酶表达下调或失活［15］。Lian 等［11］用反转录 PCR 研究发现，在恶性黑素瘤中TET1、2、3表达均明显下调，且TET2下降最明显。Gambichler等［12］用免疫组化方法研究发现，TET2的表达量在不同病理分期恶性黑素瘤中均显著降低，且肿瘤恶性程度越高，TET2表达水平越低，同时5hmC含量越低。提高体外恶性黑素瘤细胞A2058中TET2表达可有效地提高其全基因组5hmC含量，分析发现，5hmC含量显著改善的基因多与细胞间信息传递、基因表达调控等相关，用TET2过表达的A2058细胞构建裸鼠移植瘤模型，发现TET2过表达可明显抑制移植瘤体的生长［11］。Song等［16］复制了与恶性黑素瘤危险度相关的13个基因位点，单核苷酸多态性研究发现，其中名为rs4698934的核苷酸，位于TET2内含子的第106139387个位点上，部分患者该位点发生突变，因此，TET2该位点的突变可能与恶性黑素瘤发生相关。

2.3 IDH与恶性黑素瘤：IDH1/2已被证明在多种血液系统恶性肿瘤及实体肿瘤中存在突变，且常伴有 2-HG 表达的异常上调［15］。Shibata 等［17］发现，恶性黑素瘤中IDH1/2突变率可高达10%，且常伴有原癌基因BRAF和KIT基因的突变。研究发现，恶性黑素瘤中IDH2蛋白的表达也显著下调，但IDH1蛋白的表达变化并不明显［11-12］。在斑马鱼黑素瘤模型中，提高IDH2的表达，不仅可逆转5-hmC的低表达，而且能有效延长其无瘤生存期［11］。提示IDH基因突变等其他因素可能导致IDH蛋白的表达下调或者功能异常，参与恶性黑素瘤的发生。

近年来体外实验研究发现的多种IDH1和IDH2特异性抑制剂，均可有效地减少2-HG的产生，并诱导细胞正常分化，逆转肿瘤的恶性倾向［15］。为研发特异性改善异常DNA羟甲基化的药物提供更多可能性，不仅给恶性黑素瘤，更为各种恶性肿瘤的靶向治疗带来了希望。

2.4 维生素C与恶性黑素瘤：体外培养恶性黑素瘤细胞中钠依赖性维生素C转运受体表达显著下调，补充生理剂量维生素C可提高恶性黑素瘤细胞中5hmC的含量，并有效抑制其恶性转化［9］。

3 结语

虽然恶性黑素瘤中，全基因组5-hmC缺少已经比较明确，但具体基因如细胞周期调节基因、凋亡相关基因等特异性DNA羟甲基化异常尚待进一步研究。多种逆转DNA羟甲基化异常的特异性抑制剂及补充维生素C等手段，目前仅被证明在体外实验中发挥作用。开展更多更深入的研究认识DNA羟甲基化在恶性黑素瘤中的作用及具体机制，将有助于恶性黑素瘤的诊断与治疗。

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DNA hydroxymethylation in malignant melanoma

Wang Dan,Yang Shengbo,Huang Jinhua.Department of Dermatology,Third Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410013,China

DNA hydroxymethylation refersto a chemicalmodification processin which 5-methylcytosine （5mC） is converted to 5-hydroxymethylcytosine （5hmC） by the ten-eleven translocation （TET）protein family.This conversion is an important intermediate step in active DNA demethylation,which can influence gene expressions by dynamically regulating DNA methylation levels.DNA hydroxymethylation can be modulated by TET proteins,the Krebs cycle-related enzymes,vitamin C,miRNAs,etc.Like patients with hematological malignancies or other solid cancers,those with cutaneous malignant melanoma have been reported to have decreased 5-hydroxymethylcytosine levels and abnormal DNA hydroxymethylation,hinting that DNA hydroxymethylation is related to the occurrence,development and prognosis of cutaneous malignant melanoma.

Melanoma;5-Methylcytosine;DNA methylation;Isocitratedehydrogenase;DNA hydroxymethylation

Jinhua Huang,Email:huangjinhua60@126.com

2015-04-27）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.02.018

黄进华，Email:huangjinhua60@126.com

本文主要缩写：5mC：5甲基胞嘧啶，5hmC：5羟甲基胞嘧啶，DNMT：DNA甲基转移酶，α-KG：α酮戊二酸，5fC：5氟胞嘧啶，5caC：5胞嘧啶羧基，5hmU：5羟甲基尿嘧啶，IDH：异柠檬酸脱氢酶