金银花与山银花指纹图谱对比

黄海燕 饶伟文 钟建理

·实验研究·

金银花与山银花指纹图谱对比

黄海燕 饶伟文 钟建理

本文通过指纹图谱比较金银花和山银花的质量。参照《中国药典》2015年版收载的含量测定的方法建立两个系统的指纹图谱,对50批样品进行指纹图谱分析。木犀草苷分析系统下的金银花(忍冬)和山银花指纹图谱相似度高,皂苷分析系统下的指纹图谱不同品种间相似度低。木犀草苷分析系统说明金银花与山银花有共同的有效成分物质基础,本系统指纹图谱不能区别具体品种。皂苷分析系统中不同品种的指纹图谱有较明显的区别,可用于金银花与山银花具体品种的鉴别参考。金银花与山银花所含主要成分有相似,也有差异,建议汤剂配方、口服或外用的中成药,金银花与山银花均可通用,而中成药注射剂应使用金银花,且使用前应做皂苷限度检查。

金银花；山银花；主要成分；指纹图谱

金银花和山银花是清热解毒的常用中药。《中国药典》2005年版开始,将金银花和山银花分列,金银花以绿原酸、木犀草苷为定量指标,山银花以绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的总量为定量指标。何兵、熊艳、张芳等［1-3］建立了金银花或山银花指纹图谱并进行质量分析。但实验样品批次较少,产地较单一,4种山银花的品种仅收集到灰毡毛忍冬1种,品种代表性不够,对金银花和不同品种山银花的质量评价结果说服力不足。为了进一步比较金银花和山银花的质量,指导临床和生产的合理应用,本文采集或收集50批不同产地金银花、山银花,参照《中国药典》2015版金银花和山银花项下收载的含测方法［4］,分别测定相关成分的含量,同时通过两个液相色谱系统,进行指纹图谱对比,现将指纹图谱研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1仪器 waters 2695/2998/2487 液相色谱仪,Alltech 3300 ELSD检测器,XS205DU梅特勒电子分析天平,KQ-600E型超声仪,SIGMA 3-30K高速台式冷冻离心机,Lab Tech EV311旋转蒸发仪。

1.2材料

1.2.1木犀草苷照品(批号：111720-201307),绿原酸对照品(批号：110753-201314),异绿原酸 A(3,5-二咖啡酰奎宁酸)对照品(批号：111782-201405),异绿原酸 C(4,5-二咖啡酰奎宁酸)对照品(批号：111894-201102),灰毡毛忍冬皂苷乙对照品(批号：111814-201303),川续断皂苷乙对照品(批号：111813-201202),均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲酸、冰醋酸为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为高纯水。

1.2.2金银花19批、灰毡毛忍冬12批、红腺忍冬15批、黄褐毛忍冬3批和华南忍冬1批,均系本所采集或收集,并由饶伟文主任药师对其植物品种进行了鉴定,金银花为忍冬Lonicera japonica Thunb.,灰毡毛忍冬为Lonicera macranthoides Hand.一Mazz.,红腺忍冬为Lonicera hypoglauca Miq.,华南忍冬为Lonicera confusa DC.,黄褐毛忍冬为Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng。

2方法与结果

2.1木犀草苷分析系统

2.1.1溶液的配制

2.1.1.1对照品溶液 精密称取木犀草苷、绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C 对照品适量,分别置50 ml容量瓶中,用70%乙醇溶解并稀释至刻度,制成每1 ml各含40 μg的对照品溶液。

2.1.1.2供试品溶液 取本品细粉(过4号筛)约2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇50 ml,称定重量,超声处理(功率250 W,频率35 kHz)1 h,放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液10 ml,回收溶剂至干,残渣用70%乙醇溶解并转移至5 ml量瓶中,加70%乙醇至刻度,即得。

2.1.2色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6× 250 mm,5 μm；流动相：乙腈为流动相A,0.5%冰醋酸为流动相B,梯度洗脱程序见表1；流速1.0 ml/min；检测波长：350 nm；柱温：30.0℃；进样10 μl。分别取对照品溶液、供试品溶液,按上述色谱条件测定,记录色谱图。见图1。

表1 木犀草苷分析系统梯度洗脱程序

图1 木犀草苷分析系统的HPLC图

2.1.3测定结果 木犀草苷分析系统中,金银花和山银花共50批样品色谱图均相似,峰3为木犀草苷,另外所有样品均检测到的3个较大的色谱峰经对照品保留时间和紫外吸收图比对,鉴定为绿原酸、异绿原酸A(3,5-二咖啡酰奎宁酸)和异绿原酸C(4,5-二咖啡酰奎宁酸)。将色谱图以AIA格式输入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)”。以金银花1号样品为参照图谱,采用中位图谱生成方式,时间宽度为0.5,分别对所有样品的色谱信息进行相似度评价分析,结果相似度均＞0.99,表明金银花和各品种山银花在这个液相系统检测到的化学成分相对一致,但本系统指纹图谱不能区别具体品种。

2.2皂苷分析系统

2.2.1溶液的配制

2.2.1.1对照品溶液 精密称取绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙对照品适量,分别置25 ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,制成每1毫升各含200 μg的对照品溶液。

2.2.1.2供试品溶液 取样品粉末(过4号筛),取约0.3 g,精密称定,精密称定,置50 ml 离心管中,加50%甲醇40 ml并混匀,超声处理40 min(功率250 W,频率35 kHz),离心10 min (5000转/min),取上清液转移至50 ml量瓶中,残渣加50%甲醇7 ml涡旋1 min,离心10 min(5000转/min),合并上清液至同一量瓶中,加50%甲醇至刻度,混匀,以0.45 μm微孔滤膜滤过,即得。

2.2.2色谱条件 色谱柱：Phenomenex Gemini C18 4.6×250 mm,5 μm；流动相：0.4%甲酸为流动相A,乙腈为流动相B,梯度洗脱程序见表2；流速1.0 ml/min；柱温：30.0℃；进样10 μl；蒸发光散射检测器(ELSD)漂移管温度：60℃,气体流量：2.0 L/min。分别取对照品溶液、供试品溶液,按上述色谱条件测定,记录色谱图。见图2。

表2 皂苷分析系统梯度洗脱程序

图2 皂苷分析系统的HPLC图

2.2.3测定结果 皂苷分析系统中,山银花的相同品种的样品之间色谱图较相似,重复性好；19批金银花(忍冬)大部分也较一致,未检出川续断皂苷乙和灰毡毛忍冬皂苷乙,但有7批检出川续断皂苷乙峰,其中3批同时检出灰毡毛忍冬皂苷乙峰。

品种之间色谱图有差异,灰毡毛忍冬和红腺忍冬色谱图相对其他品种较接近,只峰面积比不同,灰毡毛忍冬的灰毡毛忍冬皂苷乙峰明显大于川续断皂苷乙峰,而红腺忍冬的灰毡毛忍冬皂苷乙峰小于川续断皂苷乙。金银花(忍冬)色谱图在两个皂苷峰保留时间附近几乎没有色谱峰。

将色谱图以AIA格式输入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)”,采用中位图谱生成方式,时间宽度为0.5,分别对所有样品的色谱信息进行相似度评价分析,结果灰毡毛忍冬、红腺忍冬、黄褐毛忍冬相同品种之间相似度较高,不同品种之间的相似度则较低。表明金银花和各品种山银花在这个液相系统检测到的化学成分有差异。特别是皂苷部分,品种之间的皂苷成分的种类和含量不同。用系统的指纹图谱可用于金银花与山银花具体品种的鉴别。

3 讨论

由于中药化学成分的复杂性,普遍存在多组分共存、多种药理作用综合起效的情况。有文献报道金银花和山银花的药理作用相同,均有抗菌、抗病毒、退热和抗炎等作用,不论是金银花还是山银花都可以有效地抑制链球菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、绿脓杆菌等病菌［5,6］；亦有研究报道,虽然灰毡毛忍冬和忍冬的几种有效成分含量存在较大差异,但它们对6种常见致病菌均有明显地抑菌和杀菌作用,而且在抗菌、抗炎、解热、免疫调节等方面,灰毡毛忍冬与忍冬的作用相当［7］。中国药典的金银花和山银花两个品种的性味归经、功能主治、用法用量亦完全相同,临床应用无法区分。鉴于山银花含皂苷总体偏高的情况,本文为了充分利用中药资源,汤剂配方、口服或外用的中成药,金银花与山银花可通用,但中成药注射剂应使用金银花,而且投料前应先做皂苷限量检查,以保证用药安全。

［1］何兵,刘艳,李春红,等.多指标定量指纹图谱在中药金银花质量评价中的应用.中国药学杂志,2015,50(14):1237-1242.

［2］熊艳,高慧敏,王智民,等.金银花不同干燥技术HPLC指纹图谱研究.中国中药杂志,2009,34(8):1015-1017.

［3］张芳,孙希芳,张永清,等.金银花药材的HPLC指纹图谱及绿原酸、木犀草苷含量的同时测定.四川农业大学学报,2014,32(2):154-159.

［4］魏惠珍,罗小妹,刘文霞,等.2015版《中国药典》一部增修订概况.江西中医药大学学报,2016,28(4):221.

［5］胡克杰,孙考祥,王曙璐,等.氯原酸体外抗病毒作用研究.哈尔滨医科大学学报,2001,35(6):430-432.

［6］李光玉,吴如英,王玉英,等.灰毡毛忍冬的质量研究(IV)—对普通感冒的临床疗效观察.中药材科技,1984(3):14.

［7］张小娜,唐清,侯敏,等.灰毡毛忍冬与忍冬的药理作用比较研究.中国药理学通报,2012,28(11):1582-1587.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.16.203

2016-05-19］

541001 广西桂林食品药品检验所