微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展

董迅衍， 王小元*

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

微生物生产L-苏氨酸的代谢工程研究进展

董迅衍1，2， 王小元*1，2

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

L-苏氨酸作为一种必需氨基酸被广泛用于食品、饲料、医药及化妆品行业。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵法生产。代谢工程技术的应用为菌种选育开辟了有效途径，使在现有高产基础上进一步提高氨基酸的产量成为可能。作者对两大氨基酸生产菌——大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中的L-苏氨酸生物合成相关途径、代谢调控机理以及运用代谢工程技术提高L-苏氨酸产量所取得的成果进行了系统综述。

L-苏氨酸；谷氨酸棒杆菌；大肠杆菌；代谢工程；发酵

氨基酸发酵产业规模在过去10年中整整扩大了一倍，目前达到了500万t/年。大肠肝菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）及其亚种是发酵法生产氨基酸的主力军。其中，由微生物发酵法生产、年产量排名前三的分别是L-谷氨酸（220万t）、L-赖氨酸（195万t）和L-苏氨酸（33万t）[1-2]。如图1所示，由1993年的0.4万t/年到2014年的330万t/年，L-苏氨酸的世界年产量提高了82倍。目前，全球L-苏氨酸以每年超20%的增长率高速增长，这主要是因为L-苏氨酸在饲料添加剂行业的需求量增长迅速。近年来的研究表明，作为8种必需氨基酸之一，L-苏氨酸是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。以添加了苏氨酸的低蛋白配方饲料作为家禽日粮，不但降低了饲喂成本，还有利于家禽吸收，可促进家禽的生长[3]。除了可以缓解天然蛋白质的匮乏，家禽饲料营养配比合理还可以有效减少动物氨的排放，从而减少环境污染，有利于社会的可持续发展。此外，L-苏氨酸在食品、医药和化妆品等领域的用量也呈长期稳定增长趋势。在食品领域，L-苏氨酸是各类氨基酸保健饮品的配方成分，也是重要的食品强化剂，可以与其他氨基酸共用起到抗氧化的作用，还可以与葡萄糖共热产生焦香味。在医药领域，L-苏氨酸有促进人体生长发育、促进骨髓T淋巴细胞前体分化发育成为成熟T淋巴细胞和抗脂肪肝的药用疗效，因此在临床方面有着广泛的应用。此外，L-苏氨酸还是制造高效低过敏的抗生素单酰胺菌素等药物的中间体。在化妆品领域，L-苏氨酸的分子具有羟基结构，因此可用作保湿剂[4]。

图1 L-苏氨酸世界年产量Fig.1 L-threonine world annual yield

1 L-苏氨酸的生物合成途径

L-苏氨酸的生物合成以TCA循环中间代谢物草酰乙酸为前体。底物葡萄糖代谢经过糖酵解途径、磷酸戊糖途径、TCA循环及C3-C4回补途径等中心代谢途径，由草酰乙酸经天冬氨酸转氨酶催化生成L-天冬氨酸，即进入L-苏氨酸合成途径，见图2。此转氨反应中，由L-谷氨酸提供氨基基团。其中，C3-C4回补途径是指在磷酸烯醇式丙酮酸-丙酮酸-草酰乙酸节点处发生的C3化合物的羧化反应以及C4化合物的脱羧反应。由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）和丙酮酸羧化酶（PC）分别催化的磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸的羧化反应，直接生成草酰乙酸；而由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）催化的草酰乙酸和苹果酸的脱羧反应，则直接消耗掉草酰乙酸。在E.coli和C.glutamicum中，PEPC、PEPCK和PC均分别由ppc、pck和pyc基因编码[5]。

由L-天冬氨酸起，L-苏氨酸途径包含5步酶催化反应：1）天冬氨酸激酶（AK），催化L-天冬氨酸γ-羧基磷酸化生成磷酰天冬氨酸；2）天冬氨酸半醛脱氢酶（ASD）以NADPH为还原力，催化磷酰天冬氨酸还原生成天冬氨酸半醛；3）高丝氨酸脱氢酶（HD）以NADPH为还原力，催化天冬氨酸半醛脱羧生成L-高丝氨酸；4）高丝氨酸激酶（HK），催化L-高丝氨酸磷酸化，生成磷酰高丝氨酸；5）苏氨酸合酶（TS）催化磷酰高丝氨酸脱磷酸基团，生成L-苏氨酸。在E.coli中，AK有三种同工酶，分别为AKI、AKII和AKIII[14-15]；HD有两种同工酶，分别为HDI和HDII。AKI和HDI组成双功能酶，由thrA基因编码；AKII和HDII组成双功能酶，由metL基因编码[8]；单功能的AKIII则由lysC基因编码[17]。在3种EcAK中，EcAKI的蛋白质丰度最高，而EcAKII的蛋白质丰度最低。EcASD、EcHK和EcTS则均为单一酶，分别由 asd、thrB和 thrC基因编码[18-19]。在C.glutamicum中，上述5种酶均不存在同工酶：AK由lysC基因编码[10]；ASD由asd基因编码[9]；HD由hom基因编码[10]；HK由thrB基因编码[10]；TS由thrC基因编码[10]。L-苏氨酸由胞内向胞外转运被认为是微生物发酵生产L-苏氨酸的限速步骤。在E.coli中，有3种L-苏氨酸输出蛋白质：RhtA、RhtB和RhtC，分别由rhtA、rhtB和rhtC基因编码[11-12]。在C. glutamicum中，目前仅发现1种L-苏氨酸输出蛋白ThrE，由thrE基因编码[26-27]。

图2 L-苏氨酸生物合成途径Fig.2 Biosynthesis pathway of L-threonine

对于L-苏氨酸生物合成而言，碳流的浪费主要是由以下4条途径造成：1）其合成途径上的L-赖氨酸旁支路途径；2）L-甲硫氨酸旁支路途径；3）其合成后在胞内被降解为甘氨酸；4）用于合成L-异亮氨酸。L-赖氨酸旁支路途径在E.coli和C.glutamicum中都是由dapA基因编码的二氢吡啶二羧酸合酶（DDPS）催化起始[15]。L-甲硫氨酸旁支路途径在E.coli中则由metA基因编码的琥珀酰基转移酶（SCT）催化起始[16]；在 C.glutamicum中则由metX基因编码的乙酰基转移酶（ACT）催化起始。需要特别说明的是，在C.glutamicum中，分别存在2条L-赖氨酸合成途径（split pathway，在二氢吡啶二羧酸节点处分裂成两条途径）[17]和2条L-甲硫氨酸合成途径 （在氧乙酰高丝氨酸节点处分裂成两条途径）[18]。L-苏氨酸降解成甘氨酸的途径L-苏氨酸降解生成甘氨酸的途径在E.coli中有两条，分别由tdh基因[19]编码的苏氨酸脱氢酶（TDH）和ltaE基因[20]编码的苏氨酸醛缩酶（TA）催化起始；而在C.glutamicum中目前只发现了一条，是由glyA基因编码的丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）催化一步生成。

2 L-苏氨酸生物合成调控机制

在E.coli中，L-苏氨酸合成途径上所有基因的转录都受终端产物的反馈阻遏调控：thrA、thrB和thrC基因的转录受L-苏氨酸和L-异亮氨酸协同反馈阻遏调控；metL基因的转录受L-甲硫氨酸反馈阻遏调控；lysC基因的转录受L-赖氨酸反馈阻遏调控；asd基因的转录受L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-甲硫氨酸共价反馈阻遏调控[21]。其中，thrA、thrB和thrC基因在染色体上组成thrABC操纵子[22]。在thrA基因可读编码框上游存在一段178 bp长度的前导序列thrL。L-苏氨酸和L-异亮氨酸对这三个基因的转录调控由thrL介导的转录衰减机制实现。在thrA基因上游37个碱基位点处插入一个G碱基可解除该转录衰减调控[23-24]。L-赖氨酸对lysC基因转录的调控则由其上游的前导序列介导的翻译衰减机制实现[25]。而在酶活水平上，EcAKI-EcHDI、EcAKIII、EcHK受终端产物反馈抑制调节。EcAKI的活性受L-苏氨酸不完全反馈抑制调节。L-苏氨酸既可通过改变EcAKI的构象，又可通过与底物L-天冬氨酸竞争结合位点抑制其活性。EcHDI的活性同样也受L-苏氨酸不完全反馈抑制调节，但抑制机制为非竞争性[6]。L-赖氨酸可以通过改变EcAKIII的构象而完全抑制其活性[26-27]。定点突变T344M、S345L及T352I均可部分解除EcAKIII受L-赖氨酸的抑制[27]。EcHK受反馈抑制情况较为复杂。它不但受终端产物L-苏氨酸的竞争性反馈抑制及L-赖氨酸的非竞争性反馈抑制，还受底物L-高丝氨酸（浓度高于1 mmol/L时）和ATP（浓度高于3 mmol/L时）的抑制调节[6]。

在C.glutamicum中，L-苏氨酸合成途径上只有hom和thrB两个基因的转录受L-甲硫氨酸反馈阻遏调节。这两个基因在染色体上按5’hom-thrB 3’方向组成一个操纵子。该操纵子5’端上游有一长串反向重复序列，预示存在衰减子作用，与hom和thrB的转录受L-甲硫氨酸反馈阻遏调节有关[28]。而在酶活水平上，CgAK、CgHD和CgHK三个酶的活性受终端产物的反馈抑制调节。CgAK是变构调节酶，其活性受终产物L-苏氨酸和L-赖氨酸的协同反馈抑制调节。多个CgAK编码基因上的突变位点均可完全解除该反馈抑制[29]。CgHD的活性受L-苏氨酸反馈抑制调节。L-苏氨酸的结合单元位于CgHD的C-端[30]。2 mmol/L L-苏氨酸即可完全抑制野生型CgHD的活性。Dieter等通过对hom基因进行G1133A单碱基突变得到的CgHDG378E突变体在25 mmol/L L-苏氨酸存在时完全不受抑制；且半抑制L-苏氨酸浓度高达100 mmol/L[31]。CgHK的活性略受L-苏氨酸反馈抑制调节。酶学动力学实验结果表明，L-苏氨酸对此酶的抑制作用系竞争性抑制：随着其底物L-高丝氨酸浓度提高，受抑制程度降低。野生型CgHK的半抑制L-苏氨酸浓度为25 mmol/L[32]。基于竞争性抑制机制——底物与抑制物结合位点为同一个，抑制的解除不能通过改变酶蛋白结构来实现，而只能依靠提高底物L-高丝氨酸的浓度来缓解[33]。

3 L-苏氨酸生产菌代谢工程研究状况

L-苏氨酸生产菌构建过程中采用的代谢工程策略主要有：1）高效表达合成途径关键酶基因，以提高合成途径碳流量；2）削弱竞争支路的碳流量，以聚拢碳流，同时减少副产物的合成；3）削弱L-苏氨酸的胞内降解；4）加快L-苏氨酸向胞外分泌，以减少L-苏氨酸的胞内降解及避免胞内产物浓度积累过高而抑制关键酶的催化活性。

3.1 加强L-苏氨酸合成途径关键基因的表达

高效表达合成途径关键酶的编码基因，尤其是抗反馈抑制的突变体基因，可以有效地提高L-苏氨酸产量。在E.coli中，高效表达thrABC操纵子是最常用的策略。Livshits等[11]在L-苏氨酸生产菌E.coli MG442中通过用质粒载体表达带有突变位点的thrA442BC操纵子，将L-苏氨酸产量由8 g/L提高到18.4 g/L。张雪等在野生型菌株E.coli W3110中通过用高拷贝质粒载体pMD19-T表达thrA345BC操纵子实现了 9.2 g/L L-苏氨酸胞外积累[34]。在C.glutamicum中，高效表达lysC，hom和thrB这三个关键基因被证实对提高L-苏氨酸合成有利。Eikmanns等[35]在 C.glutamicum DM368-3（AECr，AHVr）中通过采用质粒载体高效表达homr-thrB操纵子，将L-苏氨酸产量由6.3 mmol/L提高至14.1 mmol/L。Colon等[32]通过在 L-赖氨酸生产菌C.lactofermentum ATCC21799（AECr）中用质粒载体组成型高效表达homr，同时诱导型高效表达thrB，实现L-苏氨酸胞外积累达11.8 g/L，而原产物L-赖氨酸的产量由22.0 g/L降至0.8 g/L。

3.2 加强L-苏氨酸向胞外分泌

当L-苏氨酸积累达到一定浓度时，其由胞内向胞外的转运成为生产的限速步骤。高浓度的胞内L-苏氨酸积累会抑制合成途径关键酶的催化活性，增加降解代谢产物的合成，甚至抑制细胞生长。因此，加强L-苏氨酸向胞外分泌是非常有效的代谢工程策略。Kruse等[12]在E.coli MG422中通过用质粒载体分别表达内源的rhtB、rhtC和来自C.glutamicum的thrE，将L-苏氨酸产量分别提高了1.4倍、2倍和2.9倍。Livshits等[11]在E.coli MG422（pAYC32-thrArBC）菌株中通过对染色体上rhtA基因起始密码子上游1个碱基进行G→A替换突变以加强其转录，将L-苏氨酸产量由18.4 g/L提高到36.3 g/L。Simic等[36]通过在L-苏氨酸生产菌C.glutamicum DR-17中用质粒载体表达内源的thrE基因，将L-苏氨酸产量由5.8 g/L提高到了8.1 g/L。Diesveld等[37]通过在C.glutamicum DM368-3（AECr，AHVr）中用质粒载体异源表达来自E.coli的rhtC基因，将L-苏氨酸产量由0.9 g/L提高到了3.7 g/L，并将副产物甘氨酸的产量由1.1 g/L降低至0.15 g/L。

3.3 削弱L-苏氨酸在胞内的消耗

L-苏氨酸发酵生产的过程中主要产生的副产物有L-甘氨酸、L-异亮氨酸和L-赖氨酸，其中前两者为L-苏氨酸胞内降解代谢产物。由于转运蛋白和降解代谢途径之间相互竞争共同底物L-苏氨酸，因此，减少胞内消耗损失可提高L-苏氨酸产量，还可以减少副产物的产生，从而降低下游提取成本。Lee等[38]在一株E.coli L-苏氨酸生产菌中通过对染色体上ilvA基因进行C290T突变以降低其编码的TD的催化活性，并通过敲除染色体上的tdh基因以减少 L-苏氨酸胞内消耗。Diesveld等[24]在 C. glutamicum DM1800-T中通过对染色体上ilvA基因进行定点突变使其编码的TD失活，将L-苏氨酸产量由2.5 g/L提高到4 g/L。

3.4 系统代谢工程

系统代谢工程技术的应用给L-苏氨酸生产菌的构建带来了突破性的进展。通过系统代谢工程改造，研究人员成功构建出了几株E.coli L-苏氨酸高产菌株。最典型的案例是由Lee等[72]从野生型的E.coli W3110构建出高产 L-苏氨酸的 TH28C（pBRThrABCR3）。他们首先将E.coli W3110染色体上的lacI基因敲除，使一些强启动子如Ptac和Ptrc可以进行组成型转录。其次，通过三步改造来加强L-苏氨酸合成途径：1）对染色体上thrA和lysC基因分别进行C1034T和C1055T定点突变，以解除AKI和 AKIII的反馈抑制调节；2）将染色体上thrABC操纵子的启动子替换成Ptac启动子，以解除反馈阻遏调节；3）将解反馈抑制的thrABC操纵子放到质粒载体上过表达。接着，通过削弱竞争支路途径及L-苏氨酸降解代谢途径来减少副产物并聚拢碳流：1）敲除染色体上的lysA基因（编码L-赖氨酸合成途径上最后一个酶）以阻断L-赖氨酸的合成；2）敲除染色体上的metX基因以阻断L-甲硫氨酸支路；3）敲除染色体上的tdh基因减少L-苏氨酸向甘氨酸的转化；4）通过对染色体上ilvA基因进行C290T突变以降低TD的催化活性，从而减少L-苏氨酸向L-异亮氨酸的转化。随后，通过加强前体草酰乙酸的供应来提高L-苏氨酸产量：1）将染色体上ppc基因的启动子替换成Ptrc启动子以加强其转录；2）敲除染色体上编码异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶的阻遏蛋白的iclR基因，以加强乙醛酸循环。再者，通过敲除L-苏氨酸吸收转运蛋白基因tdcC以及用质粒载体过表达rhtA、rhtB和rhtC基因来加强L-苏氨酸的分泌。最后，通过将染色体上乙酰辅酶A合酶编码基因acs的启动子替换成Ptrc启动子以加强其转录，从而减少乙酸的积累。最终构建得到的菌株TH28C（pBRThrABCR3）在罐上分批补料发酵50 h可生产82.4 g/L L-苏氨酸。L-苏氨酸-葡萄糖转化率达到39.3%。并且不积累L-乳酸，仅积累2.35 g/L乙酸，见图3。

另一个典型案例是Lee等[39]从基因组精简的E.coli MDS42出发构建出一株不含游离质粒的L-苏氨酸高产菌MDS-205。在MDS-205中，染色体上thrABC操纵子的启动子被Ptac启动子替换，而lacI、tdh基因被敲除；L-苏氨酸吸收蛋白基因tdcC和sstT被突变型L-苏氨酸分泌蛋白基因rhtA23所替换。MDS-205在罐上发酵30 h可生产40.1 g/L L-苏氨酸，糖酸转化率达到39.3%。该菌最大的特点是细胞生长强劲，尤其适合高密度细胞培养，可缩短发酵周期。

4 展望

随着市场需求量的不断加大，L-苏氨酸产业优化需要进一步提高产量、降低成本。我国L-苏氨酸生产起步较晚，21世纪初主要依靠进口，近几年虽然自主生产发展迅速，但是，我国饲料产业对L-苏氨酸的需求量进一步加大。随着人们保健意识的加强以及L-苏氨酸作为药物中间体等新价值的开发，L-苏氨酸在医药行业的应用越来越广。因此，构建L-苏氨酸高产菌对社会发展及国民经济具有重要意义。目前工业上发酵生产L-苏氨酸普遍采用E. coli菌株。其优点是生长迅速，发酵周期短，产量高。而在工业上产量排名前三（发酵法生产）的氨基酸中，除了L-苏氨酸，L-谷氨酸和L-赖氨酸均采用C. glutamicum发酵生产。C.glutamicum是非致病的格兰氏阳性菌，符合食品安全标准，不生芽孢，并且生长也较快，被普遍认为是氨基酸发酵生产的理想菌种。然而C.glutamicum的L-苏氨酸合成能力在过去20年中始终未获得突破性的提高——L-苏氨酸产量和糖酸转化率都远低于E.coli。作者所在团队从开发适用于C.glutamicum的分子操作工具（如基因表达和敲除载体）入手[40-43]，致力于C.glutamicum的氨基酸代谢工程研究[44-47]，对C.glutamicum的L-苏氨酸合成能力仍在挖掘中[48-50]。目前微生物发酵生产L-苏氨酸的糖酸转化率仅为40%~50%，与理论最大转化率81%相比[38]，还有很大提升空间。运用代谢工程技术构建生产菌相对于传统育种的优点是可以大大缩短菌种选育的周期。此外，由于构建出的菌株遗传背景明确，后期发酵优化过程将可相应得到简化。

图3 L-苏氨酸生产菌的代谢工程优化Fig.3 Metabolic engineering of L-threonine production strains

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Advances in Microbial Metabolic Engineering to Increase L-Threonine Production

DONG Xunyan1，2， WANG Xiaoyuan*1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

As an essential amino acid for mammals，L-threonine has a wide application in the food，feeds，pharmaceutical and cosmetics industries.To date，L-threonine is almost exclusively produced through microbial fermentation.Metabolic engineering provides an effective means to strain development and thus to enhancing the L-threonine production.In this article，the pathway and regulation of L-threonine in the major industrial strains，Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli are summarized，and advances on metabolic engineering to increase L-threonine production are reviewed.

L-threonine，Corynebacterium glutamicum，Escherichia coli，metabolic engineering，fermentation

Q 933

A

1673—1689（2016）12—1233—08

2016-07-08

国家973计划项目（2012CB725202）；国家自然科学基金项目（NSFC31370131）；江南大学博士科研基金项目（JUDCF11025）。作者简介：董迅衍（1986—），女，江苏无锡人，发酵工程博士研究生，主要从事氨基酸生产菌株代谢工程方面的研究。Email：xunyandong@gmail.com

*通信作者：王小元（1965—），男，山西垣曲人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事工业微生物代谢工程方面的研究。E-mail：xwang@jiangnan.edu.cn