荧光光度法测定竹叶柴胡地上部分不同部位总黄酮含量

樊秦娥，胡杨根，叶方

(十堰市太和医院湖北医药学院附属医院产科，湖北 十堰 442000)

荧光光度法测定竹叶柴胡地上部分不同部位总黄酮含量

樊秦娥，胡杨根，叶方

(十堰市太和医院湖北医药学院附属医院产科，湖北 十堰 442000)

目的 分析竹叶柴胡不同部位总黄酮含量，研究黄酮在柴胡不同部位的分布，为中药资源合理开发利用提供参考。方法以芦丁为对照品，以5%硝酸铝与样品中黄酮成分产生络合反应，选择激发波长λex=445 nm，发射波长λem=484 nm，应用荧光光度法测样品的荧光光度值，计算总黄酮含量。结果以芦丁在0.198～3.168 μg/mL范围内与荧光强度线性关系良好，y=0.972 8x-0.001，r2=0.999 3。竹叶柴胡花、叶、茎中总黄酮含量最分别为3.08%、1.85%、0.41%。结论竹叶柴胡花、叶中总黄酮含量较高，应在开花期采收竹叶柴胡地上部分。

竹叶柴胡；总黄酮；荧光光度法

柴胡为伞形科柴胡属多年生草本植物，最早收载于《神农本草经》，原名茈胡，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气的功效，《中国药典》收载(北)柴胡Bupleurum chinense DC.和南柴胡(狭叶柴胡)B.scorzoneri folium Willd.作为正品柴胡[1]，但除大叶柴胡外，很多其他柴胡品种在药材市场上也作为柴胡广泛应用[2]。鄂西北地区主要分布竹叶柴胡(Bupleurum marginatum Wall ex DC)，习惯以北柴胡之名远销国内外，品质较好[3]。柴胡中主要含有皂苷类和黄酮类活性成分，皂苷类成分具有解热、抗炎、镇静、镇痛、保肝、抗肿瘤等药理作用，黄酮类成分具有杀菌、抗病毒等作用[4-6]，黄酮类化合物主要分布在植株的地上部分[7]，竹叶柴胡植物地上部分占植株的比例较大，生产中通常都被丢弃，造成了资源浪费。为了更好地利用中药资源，进一步考察不同部位黄酮成分分布情况，我们对地上部分花、茎、叶中总黄酮含量进行分析比较，为开发利用地上部分提供参考。

1 仪器与材料

F-7000荧光光谱仪(日立)；GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱(上海博弈实业有限公司医疗设备厂)，MBE-20A 1000克密封型摇摆式粉碎机(温岭市迈邦机械设备有限公司)，SQP分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，KQ-250D型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，SHZ-DⅢ循环水式多用真空水泵(河南宇科自动化仪器仪表设备有限公司)，旋转蒸发器RE-52A(上海亚荣生化仪器厂)。

柴胡药材采自湖北医药学院百草园，由湖北医药学院药学院叶方副教授鉴定，见表1。去杂质，枯枝，洗净，45℃烘干，粉碎，过3号筛备用。芦丁对照品(GR-133-140106)购自南京广润生物制品有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，水为自制超纯水，其他试剂均为分析纯。

表1 柴胡样品及来源、含量测定结果(n=3)

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10 mg于50 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解并稀释至刻度，冷藏储存备用。

2.2 样品溶液的制备 精密称取柴胡样品粉末1 g，置于50 mL圆底烧瓶中，加石油醚25 mL，70℃水浴回流2 h，弃石油醚液，药渣挥干石油醚后加60%乙醇30 mL，70℃回流提取2 h，滤过，60%乙醇洗涤药渣和容器，合并滤液转移至50 mL容量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度[8]得溶液A1～A5。从A1～A5中精密量取5 mL置50 mL容量瓶中，以60%乙醇稀释至刻度，得到供试品溶液B1～B5。

2.3 测定方法及测定波长的选择 精密量取0.5 mL对照品溶液于10 mL容量瓶中，加入5%硝酸铝溶液1 mL，pH=5的HAc-NaAc缓冲溶液3 mL，用60%乙醇稀释至刻度[9]。精密量取B1溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，同法操作。根据芦丁等黄酮类成分在酸性条件下与硝酸铝反应产生荧光物质的特点，取两种溶液进行激发光谱和发射光谱扫描：固定激发波长(λex)，扫描发射波长(λem)在200～700 nm范围内芦丁对照品及样品溶液荧光强度，结果最佳λem为484 nm，见图1；固定λem484 nm，扫描λex在200～700 nm范围内芦丁对照品及样品溶液荧光强度，结果最佳λex为445 nm，见图2～图4。因此，确定测定波长：激发波长为445 nm，发射波长484 nm，狭缝宽度为5 nm。

图1 固定激发波长，扫描对照品发射波长

图2 固定发射波长，扫描对照品激发波长

图3 固定激发波长，扫描样品发射波长

图4 固定发射波长，扫描样品激发波长

2.4 线性关系考察 准确吸取此溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入5%的硝酸铝溶液1 mL，pH=5的醋酸-醋酸钠缓冲液3 mL。用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即配成标准工作溶液。以60%乙醇溶液作空白对照，按“2.3”项下操作，测定荧光强度。以荧光强度对相应的浓度作图，绘制标准曲线。结果芦丁的线性回归方程为：y=0.972 8x-0.001，r2=0.999 3，说明在0.198～3.168 μg/mL范围内芦丁浓度与其荧光强度呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密量取芦丁对照品溶液0.5 mL，按照“2.3”项下操作，连续测定荧光强度5次，记录荧光强度值。结果RSD为0.24%，说明仪器精密度良好。

2.6 重现性试验 取同一样品6份，按样品测定方法操作，测定荧光强度。结果RSD为0.92%，表明方法重现性良好。

2.7 稳定性试验 取同一样品溶液在0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h内测定荧光强度，结果RSD为0.89%，表明样品供试品溶液在4 h内检测对结果无影响，稳定性良好。

2.8 加样回收试验 精密称取芦丁对照品21.04 mg，稀释至50 mL量瓶中，得到0.42 mg/mL的对照品溶液。精密称取4号样品0.5 g于50 mL圆底烧瓶中，加入5 mL 0.42 mg/mL的对照品溶液，依次按照“2.2”及“2.3”方法处理进行加样回收试验，计算加样回收率(n=6)，结果平均回收率为97.91%，相对标准偏差为1.33%，见表2。

2.9 样品测定结果 精密吸取供试品溶液B1～B5各0.5 mL于10 mL容量瓶中，按“2.3”方法测定荧光光度值，以60%乙醇溶液作为空白对照，计算样品中总黄酮的含量，样品1（生长部位：叶，2年）总黄酮含量0.35%；样品2（生长部位：叶，1年）1.85%；样品3（生长部位：花，1年）3.08%；样品4（生长部位：茎，1年）0.41%；样品5（生长部位：茎，2年）0.95%。

表2 芦丁加样回收率

3 讨 论

竹叶柴胡茎、叶、花中总黄酮含量测定结果显示，1年生柴胡花中总黄酮含量最高，为3.08%，叶中总黄酮含量为1.85%，茎中总黄酮含量最低，只有0.41%。2年生柴胡花中总黄酮没有检测，但2年生柴胡叶中总黄酮含量低于1年生，而茎中含量高于1年生柴胡，1年生柴胡茎叶中黄酮总量高于2年生柴胡，说明柴胡不同部位黄酮类成分的累积规律与生长周期的变化不呈相关性。如果以柴胡总黄酮作为主要疗效成分时，应在一年生柴胡开花期采收，同时由于茎中总黄酮含量较低，所以在种植中可以通过给柴胡打顶收集柴胡叶和花作为原料，即能保证柴胡主要药用部位根茎的生长，还能综合利用资源。

[1]国家药典委员会.中国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2015: 280-281.

[2]梅赞,杨杰,范慧佳,等.4种柴胡地上部分黄酮类成分的含量测定[J].中国新药杂志,2011,20(10):932-935.

[3]杜士明,叶方,杨光义,等.鄂西北地区柴胡资源调查研究[J].中药材,2012,35(6):866-869.

[4]陈亚双,孙世伟.柴胡的化学成分及药理作用研究进展[J].黑龙江医药,2014,27(3):630-633.

[5]谭利,张庆英,李教社,等.南柴胡根中木脂素苷类化合物的研究[J].药学学报,2005,40(5):428-431.

[6]杨柳,王雪莹,刘畅.北柴胡化学成分与药理作用的研究进展[J].中医药信息,2012,29(3):143-144.

[7]谭玲玲,侯晓敏,胡正海.狭叶柴胡营养器官中柴胡皂苷和黄酮类化合物的积累部位及含量比较[J].西北植物学报,2014,34(2): 276-281.

[8]巴吐尔·买买提明,李月红,海力茜·陶尔大洪,等.荧光分析法测定岩黄芪根中的总黄酮含量[J].光谱实验室,2011,28(3):1302-1305. [9]马登磊,邵建群,何深知,等.荧光分析法测定元宝枫叶中总黄酮含量的研究[J].首都医科大学学报,2014,35(1):113-117.

Determination of total flavonoids in different aerial parts of Bupleurum marginatum by fluorescence spectrophotometry.

FAN Qin-e,HU Yang-gen,YE Fang.Department of Obstetrics,the Affiliated Hospital of Hubei Medical College(Taihe Hospital of Shiyan),Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo establish a method to determine the total flavonoid levels in flower,leaves and stalk of Bupleurum marginatum by Spectrofluorimetry,and to provided a reference for reasonable development and utilization of traditional Chinese medicine resources.MethodsBased on fluorescent property that flavonoids could make a stable complexation with Al3+,and the excitation and emission wavelengths were selected at 445 nm and 484 nm respectively with rutin as the standard sample.The total flavonoids levels were determined in the sample by fluorescence spectrophotometry.ResultsThe fluorescence intensity had a good linear relationship with rutin concentration in the range of 0.198～3.168 μg/mL.The regression equation was found to bey=0.972 8x-0.001,r2=0.999 3.The content of flavonoids in flower,leaves and stalk were 3.08%,1.85%,0.41%,respectively.ConclusionThe flower,leaves of Bupleurum marginatum contain relatively higher levels of total flavonoids,which provides a reference for harvesting the aerial parts of Bupleurum marginatum in flowering period.

Bupleurum marginatum;Total flavonoids;Fluorescence spectrofluorimetry

R93

A

1003—6350（2016）20—3319—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.017

2016-04-22)

胡杨根。E-mail：wuerfan@sina.com