TNFSF4基因rs3850641多态性与2型糖尿病的相关性研究

乔彦，谢席胜，刘瑞，何明海

(1.南充市中心医院内分泌科，四川 南充 637000；2.南充市中心医院肾内科，四川 南充 637000；3.四川大学华西医院人类疾病相关多肽研究室，四川 成都 610041)

TNFSF4基因rs3850641多态性与2型糖尿病的相关性研究

乔彦1，谢席胜2，刘瑞3，何明海1

(1.南充市中心医院内分泌科，四川 南充 637000；2.南充市中心医院肾内科，四川 南充 637000；3.四川大学华西医院人类疾病相关多肽研究室，四川 成都 610041)

目的 探讨四川南充地区汉族人TNFSF4基因rs3850641多态性与2型糖尿病(T2DM)的相关性。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术检测于2014年7月至2015年6月选取的190例正常对照者和218例T2DM患者(T2DM组)的rs3850641多态性。葡萄糖氧化酶法测定两组受检者的血糖(Glu)水平，氧化酶法测定两组受检者的血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。结果TNFSF4基因rs3850641位点等位基因频率和基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律；rs3850641多态位点G等位基因频率为0.161；T2DM组和对照组之间rs3850641位点等位基因的频率差异无统计学意义[0.163(71/168)vs 0.158 (60/190)，P＞0.05]；对照组和T2DM组rs3850641位点G基因型携带者的血糖水平分别高于各组AA基因型携带者的血糖水平[(4.72±1.43)mmol/L vs(4.50±1.30)mmol/L、(6.44±2.45)mmol/L vs(6.23±2.16)mmol/L]，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论TNFSF4基因rs3850641多态性与T2DM无关联，但其G等位基因与血糖水平相关。

汉族；2型糖尿病；TNFSF4基因；遗传多态性；相关性

糖尿病是威胁人类健康最主要的慢性非传染性疾病之一，是动脉粥样硬化性心脑血管病的独立危险因素，给全世界社会及个体带来了巨大的健康和经济负担。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性炎症性疾病。动脉内膜损伤、斑块破裂及血栓形成等动脉粥样硬化过程均有炎症反应参与[1-3]。T细胞的激活是AS的重要炎性因素之一[4]。TNFRSF4及其配体TNFSF4作为免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子，对调节巨噬细胞的抗原呈递功能、促进T细胞的增殖和分化具有重要作用，从而影响动脉粥样硬化的发生、发展[5]。经证实，TNFSF4是动脉粥样硬化的易感基因，TNFSF4基因过表达的小鼠更易出现动脉粥样硬化斑块，而定点敲除TNFSF4基因能显著减少高脂饮食诱导的动脉粥样硬化[6]。有研究证实糖尿病是一种细胞免疫性疾病[7-8]，目前尚未见TNFRSF4/TNFSF4这一参与免疫反应的信号通路与2型糖尿病(type 2diabetes mellitus，T2DM)的相关性研究。本研究旨在探讨四川南充地区汉族人TNFSF4基因rs3850641位点的基因频率分布及其与T2DM的相关性，为探讨我国汉族人T2DM的发病提供分子遗传学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 (1)T2DM组：选取2014年7月至2015年6月于南充市中心医院就诊的218例新诊断的2型糖尿病患者，所有患者均符合1999年世界卫生组织诊断标准：①糖尿病症状(多尿、多饮、多食、体重下降)加随机血糖≥11.1 mmol/L；②空腹血糖≥7.0 mmol/L；③葡萄糖负荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L)，糖尿病病程小于1年，经综合治疗后糖化血红蛋白小于6.5%。其中男性135例，女性83例，平均年龄(51±14)岁。排除1型糖尿病、其他特殊类型糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病急性并发症、感染、应激、高血压病、严重高脂血症及心、肺、肝、肾等主要脏器严重疾患。(2)对照组：随机选取无血缘关系的健康体检个体190例，其中男性121例，女性69例，平均年龄(52±15)岁。经询问病史和体检，排除心、肺、肝、肾及内分泌疾病等。所有受试对象均为汉族，均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血液基因组DNA的分离及聚合酶链反应 抽取空腹12～14 h静脉血1 mL，EDTA抗凝。按Erlich[9]微量DNA全血提取法提取基因组DNA，-20℃保存备用。PCR扩增引物由北京百泰克公司合成。引物1为5'-CACACATTGCTCCGCTATTATT-3'，引物2为5'-AGTCACTGATATACCTGGTCTACCAA-3'。PCR反应总体积25 μL，含0.5 μmol/L引物，200 μmol/LdNTP，25mmol/LMgCl2，0.2μgDNA模板，2.0UTaqDNA聚合酶。反应在DNA热循环仪上进行，PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次；72℃延伸5 min结束反应。用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，检测特异性PCR扩增产物。

1.2.2 PCR扩增产物的酶切鉴定 取10 μL PCR扩增产物，加入10 U限制性内切酶Mun I(Fermentas Biolabs)37℃保温4 h。酶切产物加入10%聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)样品槽中，在TBE缓冲液中100 V电压电泳90 min，EB染色后于Bio-Rad凝胶成像系统拍照并记录结果。

1.2.3 突变序列测定 随机挑选部分PCR扩增产物送北京三博远志生物技术有限公司进行DNA序列测定。

1.2.4 血脂测定 按酶法测定血糖、血清甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)及高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)。低密度脂蛋白胆固醇(1ow density lipoprotein cholesterol，LDL-C)按公式(TG＜4.52 mmol/L)计算：LDL-C=TC－(TG/2.1+HDL-C)。

1.3 统计学方法 所有资料均用SPSS17.0统计软件分析。定量资料以均数±标准差(±s)描述，组间血糖、血脂比较用t检验。等位基因和基因型频率采用基因计数法描述，组间比较采用χ2检验。基因型亚组AA与AG+GG组间血糖、血脂比较用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组受检者的临床及生化资料比较 T2DM组与对照组年龄与性别构成基本一致。与正常对照组比较，T2DM组患者的血糖、TG、LDL-C水平升高，而HDL-C水平则降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)；血清TC和体质量指数(body mass index，BMI)比较差异均无统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 两组受检者的临床及生化资料比较(±s)

表1 两组受检者的临床及生化资料比较(±s)

组别对照组T2DM组t/χ2值P值例数190 218年龄(岁) 52.1±14.9 51.4±14.3 0.65 0.57性别(男/女，例) 121/69 136/82 0.07 0.93 BMI(kg/m2) 22.9±2.8 23.1±3.0 0.67 0.51 Glu(mmol/L) 4.64±1.35 6.32±2.45 2.71 0.01 TG(mmol/L) 1.22±0.45 2.19±1.46 2.68 0.01 TC(mmol/L) 5.13±0.71 5.25±0.83 1.62 0.11 HDL-C(mmol/L) 1.42±0.51 0.95±0.46 3.01 0.01 LDL-C(mmol/L) 3.15±0.73 3.26±0.82 2.04 0.04

2.2 TNFSF4基因rs3850641位点的多态性分析 PCR扩增片段大小为188 bp，用限制性内切酶MunⅠ消化后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳谱上显示3种基因型：AA纯合子存在MunⅠ酶切位点，显示160 bp和28 bp 2条带；GG纯合子MunⅠ酶切位点消失，显示188 bp 1条带；AG杂合子显示188 bp、160 bp和28 bp 3条带(图1)。因28 bp的片段太短，电泳后不能在凝胶上显示，但不影响基因型的判读。对3种基因型进行DNA序列测定，测序图谱如图2，箭头所指处为碱基突变位点，测序结果与PCR-RFLP结果一致。

图1 rs3850641多态位点酶切电泳图

图2 rs3850641基因多态性PCR产物测序图谱

2.3 两组受检者的TNFSF4基因rs3850641基因型及等位基因频率比较 两组受检者的TNFSF4基因rs3850641多态性基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。由表2可见，rs3850641等位基因分布在两组均以A等位基因为常见等位基因，G等位基因为少见等位基因。rs3850641多态位点在两组均以AA基因型最多。rs3850641多态位点G等位基因频率为0.161，等位基因A、G的频率在T2DM组和对照组分别为0.837、0.163和0.842、0.158。两组间基因型频率和等位基因频率分布差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 TNFSF4基因rs3850641基因型和等位基因频率分布

2.4 两组受检者的TNFSF4基因rs3850641多态性不同基因型亚组血糖及血脂水平比较 正常对照组TNFSF4基因rs3850641多态位点血糖水平在G等位基因携带者基因型GG、AG基因型较AA等位基因携带者增高(P＜0.05)，差异具有统计学意义，T2DM组同样存在此现象(P＜0.05)。rs3850641多态位点不同基因亚组TG、TC、HDL-C、LDL-C等血脂指标差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 两组受检者的rs3850641多态性不同基因型血糖及血脂水平比较(mmol/L，±s)

表3 两组受检者的rs3850641多态性不同基因型血糖及血脂水平比较(mmol/L，±s)

组别 例数Glu TG TC HDL-C LDL-C对照组AA AG+GG t值P值T2DM组AA AG+GG t值P值190 4.50±1.30 4.72±1.43a2.12 0.03 1.25±0.37 1.20±0.36 0.53 0.62 5.11±0.67 5.15±0.79 0.30 0.91 1.39±0.50 1.46±0.52 0.45 0.79 3.17±0.61 3.13±0.87 0.38 0.87 218 6.23±2.16 6.44±2.45a2.07 0.04 2.20±1.43 2.18±1.65 0.42 0.72 5.24±0.77 5.27±0.68 0.35 0.89 0.91±0.42 1.01±0.39 0.81 0.42 3.27±0.76 3.24±0.60 0.31 0.92

3 讨 论

TNFSF4是肿瘤坏死因子受体，与其配体TNFRSF4结合后活化，作为T细胞共刺激分子，参与T细胞的活化、增殖和迁移[10]。TNFSF4在抗原提呈细胞、活化的T细胞及其他包括淋巴组织诱导细胞、内皮细胞和肥大细胞上表达。TNFRSF4则在活化的T细胞上表达。TNFSF4-TNFRSF4相互作用，影响动脉粥样硬化的形成和发展，已被作为一个自身免疫性疾病的潜在治疗靶点。

TNFSF4是目前动物实验证据最充分的动脉粥样硬化的易感基因之一。Foks等[11]在LDL受体缺陷的小鼠试验研究中发现，阻断TNFSF4/TNFRSF4信号通路，会导致动脉粥样硬化的复发。有研究表明，TNFSF4/TNFRSF4信号通路可能是糖尿病患者器官移植保护的新治疗方向[12]。人体研究发现，rs3850641位点少见的G等位基因与心梗的发生及冠心病的严重程度相关[6]。但TNFSF4基因SNP与中国汉族T2DM的相关性研究目前罕见报道。

本研究对408名汉族人TNFSF4基因rs3850641多态位点基因型分析显示，在四川南充地区汉族人中rs3850641 G等位基因的频率为0.161，类似于瑞典人群的0.138[6]及美国人群的0.155[13]，未提示rs3850641基因频率存在明显的种族差异性。但是由于地域或种族的差异及样本构成、样本量大小等因素，可能会导致研究结果的不同。T2DM组和对照组rs3850641位点A、G等位基因频率分别为0.837、0.163和0.842、0.158，该位点基因型频率和等位基因频率在T2DM组和对照组之间的分布差异均无统计学意义(P＞0.05)，未提示rs3850641多态位点与T2DM的发生有关联。进一步分析rs3850641多态性同血脂间的关系发现，rs3850641多态性与血TC、TG、HDL、LDL等血脂水平的无明显相关性，提示此位点碱基突变可能不参与血脂代谢，与文献报道一致。但是，在T2DM组和对照组中发现，rs3850641多态性G等位基因携带者血糖水平更高，差异具有统计学意义，rs3850641A→G碱基突变可能通过影响血糖水平影响动脉粥样硬化，但目前难以解释其机制。我们在对照组和T2DM组同时发现，rs3850641多态性G等位基因携带者与高水平的血糖关联，故而不能推论这一关联是否对T2DM的发生有影响。这种相关性需要进一步的功能实验加以证实，为解释rs3850641多态性对血糖水平的预测价值提供依据。

综上所述，TNFSF4基因rs3850641多态性与T2DM没有直接关联，但rs3850641位点G等位基因与四川南充地区汉族人血糖水平相关。

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Analysis of TNFSF4 gene rs3850641 polymorphisms in patients with type 2 diabetes mellitus.

QIAO Yan1,XIE Xi-sheng2,LIU Rui3,HE Ming-hai1.1.Department of Endocrinology,Nanchong Central Hospital,Nanchong 637000, Sichuan,CHINA;2.Department of Nephrology,Nanchong Central Hospital,Nanchong 637000,Sichuan,CHINA;3.Division of Peptides-Related Human Diseases,State Key Laboratory of Biotherapy,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan,CHINA

Objective To investigate the variations of TNFSF4 gene rs3850641 polymorphisms and their relationships with type 2 diabetes mellitus(T2DM)among people with Han nationality in Nanchong area of Sichuan Province.MethodsThe genotypes and allele frequencies of rs3850641 polymorphism in 218 T2DM patients and 190 control subjects,who were selected from July 2014 to June 2015,were assayed by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Serum glucose and lipids of the two groups were measured respectively by glucose oxidase method and oxidase enzymatic kits.ResultsTNFSF4 gene rs3850641 allele and genotype distributions were in Hardy-Weinberg equilibrium.The frequencies of G allele at rs3850641 site were 0.161 in total.There was no significant difference of allele and genotype frequencies between T2DM and control groups,0.163(71/168)vs 0.158(60/190),P＞0.05.Subjects with genotype GG and AG at rs3850641 sites had a significantly higher serum glucose than those with genotype AA in both control and T2DM groups,(4.72±1.43)mmol/L vs(4.5±1.30)mmol/L,(6.44±2.45)mmol/L vs (6.23±2.16)mmol/L,P＜0.05.ConclusionThese results suggest that rs3850641 polymorphism in the TNFSF4 gene may has an effect on serum glucose,but not with type 2 diabetes mellitus in the population group.

Han nationality;Type 2 diabetes mellitus;TNFSF4;Gene polymorphism;Relevance

R587.1

A

1003—6350（2016）20—3276—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.003

2016-05-05)

四川省卫生厅科研课题(编号：120283)

谢席胜。E-mail:xishengx@163.com