mTOR信号通路在神经胶质瘤干细胞样细胞中激活的意义研究

李志营 夏云 王占伟 杨伟科 焦继超

·实验研究·

mTOR信号通路在神经胶质瘤干细胞样细胞中激活的意义研究

李志营 夏云 王占伟 杨伟科 焦继超

目的探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在神经胶质瘤干细胞样细胞中激活的意义。方法通过Hoechst33342染色流式细胞仪,利用Western blot法和荧光定量-PC R法对非侧群(NSP)细胞和侧群(SP)细胞中的mTOR信号通路在神经胶质瘤干细胞样细胞中激活的意义进行分析研究。结果光定量PCR检测NSP和SP细胞中,mTOR基因的2-△Ct值为(0.289±0.042)和(0.623±0.021),两者差异有统计学意义(P＜0.05),Western blot检测结果证实,SP细胞的mTOR蛋白表达也明显高于NSP细胞(P＜0.05)。结论神经胶质瘤干细胞中存在mTOR高表达现象。

mTOR信号通路；神经胶质瘤；干细胞

恶性肿瘤是除心血管疾病以外,人类健康的第二大杀手,而神经胶质瘤又是恶性肿瘤中最为常见的一种类型,主要治疗方式为手术治疗,但患者存在一定的术后复发率,术后死亡率也相对较高。肿瘤干细胞理论研究结果提出,肿瘤内存在的部分肿瘤起始细胞是恶性肿瘤发生、发展、复发的主要原因,而这也为肿瘤的预防和治疗提供了新的途径。本次医学研究就对mTOR信号通路在神经胶质瘤干细胞样细胞中激活的意义进行了研究,现报告如下。

1 材料与方法

1.1细胞系及培养 细胞系及其培养方法: 用5%二氧化碳在37℃条件下进行神经胶质瘤C6细胞的培养,PRMI 1640培养液中含有100 IU/ml链霉素、100 IU/ml青霉素及10%胎牛血。

1.2试剂 本研究所用试剂包括: 美国 cell signalling 公司生产的mTOR、GAPDH抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗,北京天根生化科技(北京)有限公司生产的Trizol、SYBR Green 荧光定量检测 PCR 试剂盒,美国 Santa Cruz 公司生产的特异性mTOR 靶向 siRNA,英韦创津公司生产的Lipofectin2000、PRMI 1640 培养基,美国Millopore 公司生产的干细胞培养基,美国 Gibco 公司生产的胎牛血清,美国Sigma 公司生产的Hoechst33342和维拉帕米、链霉素、青霉素。

1.3荧光定量 PCR 检测mTOR 基因表达 分别选择NSP和SP细胞,PBS进行2次洗涤,根据Trizol 说明书要求对细胞总 RNA进行提取,反转录出第 1 链cDNA,根据 SYBR Green 荧光定量 PCR 检测试剂盒说明书要求,进行 mTOR 基因表达量的检测。使用2-△Ct值表示基因的表达量,Ct值表示基因扩增达到阈值的循环数,△Ct值越小,则证实基因的表达就越多,相应的2-△Ct值越小就说明该基因的表达就越少,△Ct值=目的基因Ct值-内参基因Ct值。

1.4侧群(SP)细胞的流式细胞仪分选 按照Goodell等研究人员提出的方案,对SP细胞的流式细胞仪进行分选,具体如下方法: 选择对数生长期的神经胶质瘤C6细胞,在5 mg/L的Hoechst 33342中加入106/ml单细胞悬液,同时,提前30 min选择1 ml细胞,并加入50 mg/L维拉帕米,后加入Hoechst 33342 作为对照,选择相应的SP亚群,连续90 min在37℃的水浴避光染色。通过美国BD 公司生产的IL6 和 IL7 双通道做门FACS AriaⅡ流式细胞仪,参考维拉帕米对照样品对SP细胞群进行选择,并在37℃无菌条件下分选。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验;计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

荧光定量PCR检测结果证实,在NSP和SP细胞中,mTOR基因的2-△Ct值为(0.289±0.042)和(0.623±0.021),两个检测结果比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。Western blot检测结果证实,SP细胞的mTOR蛋白表达也明显高于NSP细胞。见图2。

图1 荧光定量PCR检测,NSP和SP细胞的mTOR表达

图2 Western blot检测,NSP和SP细胞的mTOR表达

3 讨论

肿瘤干细胞是一种具有自我更新潜能和高增生潜能的一小群肿瘤起始细胞,现阶段临床常用的肿瘤干细胞分选方法包括Hoechst 33342 染色流式细胞仪SP 细胞分选、无血清球囊悬浮培养富集、免疫标记分选几种［1］,其主要原因是特异性标记的肿瘤干细胞蛋白在特定的肿瘤中并不显著,血清悬浮培养条件较为严苛,但耗时相对较少［2］,因此,SP细胞分选也是肿瘤干细胞的常见分选方法,已有的医学研究结果证实,SP细胞分选是一种最为简便且有效的富集神经胶质瘤肿瘤干细胞分选技术［3］。

mTOR信号通路对于细胞周期的调节、细胞的增值和生长具有十分重要的作用,其存在于肿瘤及其基因的发生和发展的全过程之中,且这一过程中mTOR 通路的激活起到了明显的促进作用［4,5］。mTOR属于核心丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶的一种,能够使其底物 pS6K和 4E-BPl磷酸化,产生转录因子效应,进而加速蛋白质的翻译,其中包括一些促生长、细胞周期调控、抗凋亡等蛋白的表达。

［1］张宇,伞永志,朱玉兰.mTOR信号通路在中枢神经系统疾病中的作用机制研究进展.卒中与神经疾病,2013,20(6):381-382.

［2］王通,刘玉光,张良文,等.阻断EGFR和mTOR信号通路对C6胶质瘤及其干细胞的影响.山东大学学报,2013,7(5):37-38.

［3］周福安,古丽娜尔·阿布拉江,张志明,等.PI3K/AKT/mTOR信号转导通路相关蛋白在脑胶质瘤中的表达及临床意义.临床神经病学杂志,2012,25(4):278-279.

［4］李雪源,贾爱华,任玉波,等.mTOR 信号通路蛋白在人脑胶质瘤中的表达及其临床意义.中国肿瘤生物治疗杂志,2011,18(1):75-76.

［5］李进军,刘显志,王雪峰,等.mTOR /eIF4E信号通路在不同级别人脑胶质瘤组织中的表达及临床意义.第三军医大学学报,2010,32(23):2549-2550.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.08.224

2016-12-29］

450000 河南省郑州市第七人民医院神经外科