不同补肾方对卵巢摘除术后骨质疏松大鼠Wnt信号表达的影响＊

陶 智，郑小利，薛 莎，杨文强，马 威＊＊

（1.武汉市新洲区人民医院 武汉 431400；2.武汉科技大学医院 武汉 430065；3.武汉市中西医结合医院中心实验室 武汉 430030）

不同补肾方对卵巢摘除术后骨质疏松大鼠Wnt信号表达的影响＊

陶 智1，郑小利2，薛 莎3，杨文强3，马 威3＊＊

（1.武汉市新洲区人民医院 武汉 431400；2.武汉科技大学医院 武汉 430065；3.武汉市中西医结合医院中心实验室 武汉 430030）

目的：比较3种补肾方对卵巢摘除骨质疏松大鼠Wnt通路β-Catenin mRNA表达的影响。方法：雌性SD大鼠70只，随机分为假手术组、模型组、龟鹿二仙胶组、二仙汤组、补肾活血组、雌二醇组、仙灵骨葆组，每组10只。双侧卵巢摘除术复制骨质疏松模型，术后30天进行相应的给药实验，假手术组和模型组给予灌服等量的生理盐水。12周后测定各组大鼠血清中I型胶原羧基端肽（β-Crosslaps）、I型前胶原氨基端延长肽（P1NP）含量；以双能X线骨密度测定仪测定大鼠股骨的骨密度；用RT-PCR检测右侧股骨髓LRP5、Wnt2、β-Catenin mRNA表达，用Western blot方法检测LRP5、Wnt2、β-Catenin蛋白表达。结果：与sham组比较，模型组股骨骨密度、血液PINP浓度、β-Catenin mRNA、LRP5 mRNA、Wnt2 mRNA表达均显著降低（P＜0.01），β-Crosslaps浓度显著增高（P＜0.01）。与模型组比较，3组中药组骨密度、血液PINP浓度、LRP5 mRNA、β-Catenin mRNA、Wnt2 mRNA及蛋白表达显著增高（P＜0.05），血液β-Crosslaps浓度显著降低（P＜0.01），补肾活血组骨密度及β-Catenin mRNA及蛋白表达高于其他两补肾方剂组。结论：补肾方通过Wnt信号通路促进去卵巢大鼠成骨细胞增殖而改善骨质疏松症，补肾活血组方效果更为明显。

骨质疏松 双侧卵巢摘除术 补肾 补肾活血 Wnt信号 β-连接蛋白

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是以骨组织显微结构退化，骨量减少，骨脆性增加，骨折危险性增加的一种全身性骨病，主要临床表现为疼痛、身长缩短，驼背、骨折等，与中医的“骨痿”、“骨痹”相似。中医学认为，骨与肾的关系最为密切，肾虚是骨痿及骨痹的主要病机，是骨质疏松的病机关键[1]。如《素问·宣明五气篇》有言：“肾主骨”，《素问·痿论》有言：“肾主身之骨髓”，“肾藏精，主骨生髓，其充在骨”，可见补肾是骨质疏松症治疗的关键。本文比较滋补肝肾、滋阴补肾及补肾活血等3种补肾方药对卵巢摘除大鼠骨质疏松症疗效的差异，并探讨其对Wnt信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠70只，雌性，体质量230-270 g，购于湖北省实验物研究中心[SCXK（鄂）2008-0005]，动物合格证编号：No.42000600000069。动物实验完成于武汉市第一医院SPF动物室内[SYXK（鄂）2008-0030]，湖北省动物设施使用证编号：No.00115584。动物室温度20-22℃，湿度40%-70%，12 h-12 h昼夜交替，大鼠喂饲已辐照消毒的维持饲料（北京华阜康公司），自由饮去离子水。

1.2 实验药物

阳性对照药物戊酸雌二醇片（法国DELPHARM Lille S.A.S.公司，批号：253A）在用前配制成0.02 mg·mL-1水溶液。阳性中药对照仙灵骨葆胶囊（贵州同济堂制药有限公司生产，批号：1303041）。“龟鹿二仙胶”出自《医便》，由鹿角胶500 g、龟板胶250 g、人参45 g、枸杞子90 g组成。“二仙汤”出自梁颂名《中医方剂临床手册》，由仙茅9 g、仙灵脾9 g、巴戟天9 g、当归9 g、黄柏6 g、知母6 g组成。“补肾活血方”出自我院名老中医管竞环教授经验方，由鹿角胶15 g、巴戟天9 g、熟地9 g、续断9 g、丹参9 g、党参9 g组成。上述中药材均购于湖北天济中药饮片有限公司，按传统方法煎煮后浓缩为1.0 g·mL-1生药的水煎液。以上药液配制后冷藏备用。

1.3 主要试剂与仪器

意大利产GK Vnigamma plus compact双能X线骨密度仪检测骨密度；β-Crosslaps及PINP均为罗氏C601电化学发光仪电化学发光法检测，试剂（罗氏公司，批号分别为00172416、 00172419）；引物合成于上海生工，PCR试剂（Fermentas公司）；抗体Wnt2（美国Santa Cruz公司，批号：SC-50361）、β-actin（美国Santa Cruz公司，批号：SC-130657）、LRP5（英国Abcam公司，ab187756）、β-catenin（美国Bioworld公司，批号：BS3603），水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20120116）用于动物麻醉，其他手术器械等。

1.4 实验步骤

1.4.1 模型制备

上述动物随机分为2组，造模组60只，行双侧卵巢摘除术[2]；假手术组10只，暴露卵巢组织并摘除卵巢旁脂肪组织。

1.4.2 动物分组及药物干预治疗

造模第31天时，将造模组60只动物按体重分层随机分为6组（每组10只），为龟鹿二仙胶组（Guiluerxian Glue Group，GLEX group）、 二 仙汤组（Erxian Decoction Group，EX group）、补肾活血组（BSHX Group）、雌二醇组（Estradiol valerate Group，EV group）、仙灵骨葆组（XLGB Group）、模型组（Model Group），各治疗组分别按0.01 mL·g-1剂量给于相应的药物灌胃，模型组及假手术组（Sham Operation Group） 作为对照组，分别按0.01 mL·g-1剂量灌胃生理盐水。连续给药12周。

1.4.3 样本采集

治疗结束后，首先检测骨密度，然后以10%水合氯醛麻醉，心脏采血后（分离血清备用），灌注生理盐水300-500 mL，直至流出清亮液体。取右侧股骨骨骺，-80℃冰箱保存备用。

1.5 指标检测

1.5.1 骨密度检测

动物麻醉后四肢展开平置于双能X线吸收测量仪平台上进行BMD检测。由华中科技大学附属协和医院核医学科完成检测。

1.5.2 骨代谢指标检测

血清β胶原特殊序列（β-Crosslaps）、血清I型前胶原氨基端延长肽（Procollagen Type I aminoterminal Propeptide，PINP）含量于武汉市中西医结合医院检验部检测。

1.5.3 Wnt2、LRP5及β-catenin mRNA的RT-PCR检测

参照Trizol说明书提取各组大鼠右侧股骨中骨髓的总RNA，逆转录后，进行RT-PCR，1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪采集电泳图像并分析各组条带灰度，并以β-actin为内参照，计算各指标与内参的比值作为该指标的相对含量。

1.5.4 Western Blot法 检 测 Wnt2、LRP5及·-catenin蛋白表达

组织按1:5比例加入裂解缓冲液，超速匀浆后以10 000 rpm·min-1的速度4℃离心50 min，取上清液；经蛋白定量后，调整使样本蛋白浓度相同，沸水煮5 min变性；SDS-PAGE电泳，转印至醋酸纤维素膜上；5%脱脂奶粉封闭；分别加一抗Wnt2（1:1 000）、LRP5（1:3 000）、β-catenin（1:500）、β-actin（1:2 000）4℃过夜；加二抗室温作用2 h；ECL显色，以内参β-catin含量为参照，用IPP 6.0软件对免疫印迹条带的灰度值（光密度）进行半定量分析。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 各组动物股骨骨密度比较

如表1所示，与Sham组比较，Model组股骨BMD显著降低（P=0.000）；与Model组BMD比较，EV组BMD显著增高（P=0.003），XLGB组显著增高（P=0.000），GLEX组显著增高（P=0.000），EX组显著增高（P=0.000），BSHX组显著增高（P=0.000）；与EV组BMD比较，XLGB、GLEX及BSHX组显著增高（P均为0.000）；与XLGB组比较，EX组显著降低（P=0.007）；与BSHX组比较，GLEX及EX组显著降低（P均为0.010）。这说明各治疗组均能增加模型动物骨密度含量，且补肾活血中药优于龟鹿二仙胶及二仙汤。

2.2 各组骨代谢指标比较

如表1所示，与Sham组比较，Model组β-Crosslaps含量显著增高（P=0.000），PINP含量显著降低（P=0.048）;与Model组比较，EV组β-Crosslaps显著降低（P=0.008），XLGB组β-Crosslaps显著降低（P=0.000），GLEX组β-Crosslaps显著降低（P=0.001），EX组β-Crosslaps显 著 降 低（P=0.000），BSHX组β-Crosslaps含量显著降低（P=0.000），EV组PINP含量显著增高（P=0.001），XLGB组PINP含量显著增高（P=0.001），GLEX组PINP含量显著增高（P=0.000），EX组PINP含量显著增高（P=0.000），BSHX组PINP含量显著增高（P=0.005）；与EV组比较，EX组β-Crosslaps含量显著降低（P=0.002）、BSHX组PINP含量显著增高（P=0.015）；与XLGB组比较，BSHX组PINP含量显著增高（P=0.021）；与BSHX组比较，EV组PINP含量显著降低（P=0.015），GLEX组与BSHX组之间β-Crosslaps没有差异（P=0.155）。这说明各中药治疗组骨形成（骨胶原合成）增强显著，其中补肾活血组骨形成作用优于二仙汤组，与龟鹿二仙胶组没有差异。

2.3 股骨Wnt2、LRP5、β-catenin mRNA表达比较

Wnt2、LRP5及β-catenin mRNA扩增的引物序列及退火温度见表2。经35个循环扩增后结果如表3所示（图1），与Sham组比较，Model组Wnt2 mRNA表达显著降低（P=0.000），LRP5 mRNA表达显著降低（P=0.000），β-catenin mRNA表达显著降低（P=0.000）；与Model组比较，EV、XLGB、GLEX、EX及BSHX组Wnt2mRNA表达均显著增高（P均为0.000），β-catenin mRNA表达亦显著增高（P均为0.000），XLGB、GLEX、EX及BSHX组LRP5mRNA表达显著增高（P均为0.000）；与EV组比较，XLGB组Wnt2 mRNA表达显著增高（P=0.001），GLEX组Wnt2 mRNA表达显著增高（P=0.003），EX组Wnt2 mRNA表达显著增高（P=0.001），BSHX组Wnt2 mRNA表达显著增高（P=0.000），XLGB组LRP5 mRNA表达显著增高（P=0.033），GLEX组LRP5 mRNA表达显著增高（P=0.000），EX组LRP5 mRNA表达显著增高（P=0.000），BSHX组LRP5 mRNA表达显著增高（P=0.000），XLGB组β-catenin mRNA表达显著增高（P=0.001），GLEX组β-catenin mRNA表达显著增高（P=0.000），EX组β-catenin mRNA表达显著增高（P=0.000），BSHX组β-catenin mRNA表达显著增高（P=0.000）；与XLGB组比较，BSHX组LRP5及β-catenin mRNA表达均显著增高（P=0.000，0.002）；与BSHX组比较，GLEX及EX组LRP5 mRNA表达显著降低（P=0.000，0.000）。这说明补肾中药通过上调Wnt经典通路中部分基因表达而促进骨质疏松症的改善，以补肾活血组最明显。

表1 各组动物BMD，β-Crosslaps，PINP比较（ n=10）（±s）

表1 各组动物BMD，β-Crosslaps，PINP比较（ n=10）（±s）

注：与sham组比较，*P＜0.05,**P＜0.01；与model组比较，#P＜0.05,##P＜0.01；与EV组比较，△P＜0.05,△△P＜0.01；与XLGB组比较，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；与BSHX组比较，□P＜0.05,□□P＜0.01。

F value（P） 7.702（0.000） 8.034（0.000） 35.935（0.000）

表2 PCR所检测基因引物序列

表3 各组动物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2 mRNA表达比较（ n=8）（±s）

表3 各组动物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2 mRNA表达比较（ n=8）（±s）

注：与Control组比较，P＜0.05,**P＜0.01；与Model组比较，#P＜0.05,##P＜0.01；与EV组比较，△P＜0.05,△△P＜0.01；与XLGB组比较，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；与BSHX组比较，□P＜0.05,□□P＜0.01。

Group Wnt2 β-catenin LRP5 Sham 组 1.03±0.20 1.95±0.16 1.63±0.51 Model组 0.53±0.11** 1.05±0.18** 0.96±0.24**EV组 1.23±0.12## 1.62±0.17## 1.14±0.23 XLGB组 1.50±0.14##△△ 1.82±0.20##△ 1.62±0.19##△△GLEX组 1.48±0.15##△△ 2.06±0.17##△△▲□ 1.91±0.23##△△▲□□EX组 1.52±0.19##△△ 1.96±0.20##△△□ 1.51±0.18##△△□□BSHX组 1.58±0.20##△△ 2.32±0.20##△△▲ 2.63±0.22##△△▲▲F值（P） 44.520（0.000） 32.565（0.000） 30.448（0.000）

图1 各组β-actin、Wnt2、β-catenin、LRP5 mRNA表达比较

2.4 股骨Wnt2、LRP5、β-catenin 蛋白表达比较

Western blot实验结果（见表4、图2）显示，与Sham组比较，Model组Wnt2，β-catenin，LRP5显著降低（P均为0.000）；与Model组比较，XLGB、GLEX、EX及BSHX组Wnt2蛋白显著增高（P均为0.000），EV组β-catenin蛋白显著增高（P=0.002），XLGB、GLEX、EX及BSHX组β-catenin含量显著增高（P均为0.000），XLGB、GLEX，EX及BSHX组LRP5含量增高（P均为0.000）；与BSHX组比较，GLEX及EX组Wnt2含量显著降低（P=0.001，0.000），β-catenin含量降低（P均为0.000），LRP5含量亦显著降低（P均为0.000）。

3 讨论

中医学普遍认为肾虚为“骨痿”、“骨痹”的根本，其症状与现代医学中的骨质疏松症相似[3]。《医经精义·脏腑所合》有言：“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者，肾之所合也。髓者，肾精所生，精足则髓足，髓在骨内，髓足者骨强”，可见肾与骨的关系最密切。肾藏精，主骨生髓。骨精充足，骨髓生化有源，骨骼才得以滋养，若肾精亏虚，骨髓失养，则易出现骨质疏松。因此，补肾是治疗骨质疏松症的关键所在。作为先天之本的肾，如果功能失常，则骨骼失养，行血无力，易形成血瘀；而血瘀使骨髓不能得到滋养，髓少筋枯引发骨痿（骨质疏松）[4]，当治以温肾阳、滋肾阴、活血化瘀。龟鹿二仙胶阴阳并补，气血兼顾，方中鹿角胶温肾壮阳益精补血，龟板胶填精补髓滋阴养血，人参补后天脾胃之气，枸杞子益肝肾，补精血。二仙汤滋阴补肾，方中仙茅、仙灵脾、巴戟天温肾阳，补肾精；黄柏、知母泻肾火、滋肾阴；当归温润养血，调理冲任。补肾活血方补肾活血，方中鹿角胶温补肝肾益精养血，巴戟天、续断补肾阳，强筋骨，熟地养阴填精益髓，党参健脾益气，丹参活血祛瘀生新。三方相较，龟鹿二仙胶重在阴阳并补，二仙汤在于补泻结合，经验方在于补肾活血。

表4 各组动物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2蛋白表达比较（ n=5）（±s）

表4 各组动物股骨β-catenin、LRP5、Wnt2蛋白表达比较（ n=5）（±s）

注:与Sham组比较，*P＜0.05,**P＜0.01；与Model组比较，#P＜0.05,##P＜0.01；与EV比较，△P＜0.05,△△P＜0.01；与XLGB组比较，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；与BSHX组比较，□P＜0.05,□□P＜0.01。

Wnt2 β-catenin LRP5 Group Sham组 0.858±0.067 0.713±0.094 0.608±0.089 Model组 0.460±0.063** 0.326±0.080** 0.262±0.063**EV组 0.513±0.074 0.543±0.088## 0.362±0.084 XLGB组 0.794±0.105##△△ 0.820±0.083##△△ 0.671±0.098##△△GLEX组 0.836±0.111##△△□□ 0.814±0.082##△△□□ 0.577±0.107##△△□EX组 0.770±0.087##△△□□ 0.672±0.091##△▲□□ 0.547±0.119##△△□BSHX组 1.054±0.124##△△▲▲ 1.099±0.148##△△▲▲ 0.712±0.112##△△F Value（P） 24.507（0.000） 30.651（0.000） 24.507（0.000）

Wnt是一种分泌型、富含半胱氨酸的蛋白，Wnt信号通路十分保守，在各种生物之间其成员具有高度同源性[5]。研究表明，经典wnt/β-catenin信号途径在成骨细胞分化增殖中发挥重要作用，LRP5作为Wnt的共同受体，Wnt蛋白与其胞外区结合，再与Fzd受体结合形成复合物而将信号从胞外传导至胞内，在LRP5功能获得性突变小鼠G171V中发现大量成骨细胞存在，且碱性磷酸酶表达和矿化能力也随之增强[6，7]，成骨细胞膜上的LRP5作为Wnts的辅助受体可以诱导成骨细胞内的一系列信号传递，人类LRP5基因功能获得性突变可引起骨密度增加，而其功能缺失性突变将引起骨质疏松-假神经胶质瘤综合征的发生[8]。β-catenin是Wnt经典信号通路中的关键因子，它在Wnt信号通路被激活时与核内转录因子（TCG/LET）DNA结合改变DNA的结构，启动下游靶基因转录，促进成骨细胞的分化与增殖。β-catenin基因缺失的动物I性胶原、骨钙素表达的明显减少，骨形成和骨矿化能力衰减[9]。绝经后骨质疏松主要是雌激素缺乏引起的，雌激素缺乏导致对破骨细胞有抑制作用减弱；除雌激素受体通路外，它也通过Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞的增殖与分化。研究显示在雌激素缺乏的动物模型中应用雌激素受体阻断剂后，β-catenin表达降低，且成骨细胞标志物减少；另外在骨髓基质细胞ST-2体外培养环境中加入雌激素会引起骨保护素蛋白和mRNA表达增高，继而抑制破骨细胞的分化与增殖[10，11]。

图2 各组β-actin、Wnt2、β-catenin、LRP5 蛋白表达比较（Western Blot）

本实验显示，补肾方对骨形成有促进作用，这从去势动物骨密度增加得到证明；三组补肾方β-catenin、LRP5、Wnt2 mRNA表达均较模型组显著增高（P＜0.01），说明均能通过Wnt经典通路改善去势动物骨质疏松症状；补肾活血组骨密度高于二仙汤组和龟鹿二仙胶组（P＜0.05），且作为Wnt经典信号通路关键的β-catenin mRNA表达亦高于其他两组（P＜0.01），提示补肾活血方能更好地通过Wnt经典通路改善去势大鼠骨质疏松症。本实验结果仅来源于体内试验，还需要更多的拆方及体外细胞学实验阐明补肾活血方通过Wnt经典通路防治骨质疏松症的机制。

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Effects of Different Prescriptions of Tonifying Kidney on Wnt Signaling in Ovariectomy-Induced Osteoporosis Rats

Tao Zhi1,Zheng Xiaoli2,Xue Sha3,Yang Wenqiang3,Ma Wei3
(1. Clinical Laboratory,Wuhan Xinzhou District People’s Hospital,Wuhan 431400,China; 2. Integrated Department,Hospital of Wuhan University of Science and Technology,Wuhan, 430060,China; 3. Center of Experimental Medicine,Wuhan Integrated TCM & Western Medicine Hospital,Wuhan,430022,China)

This study aimed to explore the effects of three differenct prescriptions of tonifying kidney on the expression of β-Catenin mRNA of Wnt signaling pathway in osteoporosis rats. In this experiment,70 female SD rats with the weight of 250±20 g were randomly divided into seven groups: the sham-operation group （the control group）,the model group,the Guilu Erxian glue group,the Erxian decocotion group,the torifying kidney and promoting blood flow treatment group （TCM group）,the estradiol treatment group （the E group） and Xianlin Gubao group,with 10 rats for each group. The osteoporosis model was established by bilateral ovariectomy. The control group underwent sham surgery,while the other six groups administered by bilateral ovariectomy. Rats had been given corresponding treatments for 30 days after the operation. And twelve weeks later,the femoral bone mineral density （BMD） was detected by dual-energy X-ray absorptiometry,and plasma type I collagen carboxy-terminal peptide （β-Crosslaps） and amino-terminal propeptide of type I procollagen （PINP）,the mRNA and protein expression of Wnt2,LRP5 and β-catenin extracted from the right femoral bone marrow weretested by RT-PCR and western blot,respectively. It was found that compared with the control group,BMD,plasma PINP level and the mRNA and protein expressions of Wnt2,LRP5 and β-Catenin in the model group were decreased significantly （P ＜ 0.01）,while the β-Crosslaps expression increased （P ＜ 0.01）. Compared with the model group,BMD,PINP and the mRNA and protein expressions of Wnt2,LRP5 and β-Catenin in the three groups treated by three different tonifying-kidney prescriptions were increased obviously （P ＜ 0.05）,while the expression of β-Crosslaps attenuated （P ＜ 0.01）,and the BMD,the mRNA expression of β-Catenin in the TCM group was higher than that in the Guilu Erxian glue group and the Erxian decocotion group. In conclusion,the three torifying-kidney related prescriptions may improve the state of osteoporosis through regulating Wnt signaling pathway. Thus,the osteoblast proliferation in osteoporosis rats was promoted by the prescription of tonifying kidney and activating blood circulation.

Osteoporosis,ovariosteresis,tonifying kidney,traditional Chinese medicine of enriching kidney and promoting blood flow,Wnt signaling pathway,β-catenin

10.11842/wst.2016.05.020

R68

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2015-12-15

修回日期：2016-03-07

＊ 武汉市卫生局中西医结合课题（武卫[2005]294号）: 辨证论治与元素含量优化组方对骨质疏松症干预的实验研究，负责人：马威。

＊＊ 通讯作者：马威，副主任技师，主要研究方向：中药药理与分子生物学。