·短篇论著·外源性H2S干预对O3致哮喘小鼠气道反应性和气道重塑的影响*

周丽芬，　林启旺，　廖　莉，　梁梓明，　陈庆梓，　陈玲玲，　黄佳婷，　李建华△

(广州医科大学1基础学院，2第三临床学院， 广东 广州 511436)



▲并列第1作者

·短篇论著·外源性H2S干预对O3致哮喘小鼠气道反应性和气道重塑的影响*

周丽芬1▲，林启旺2▲，廖莉2，梁梓明2，陈庆梓1，陈玲玲2，黄佳婷2，李建华1△

(广州医科大学1基础学院，2第三临床学院， 广东 广州 511436)

[摘要]目的： 探讨外源性硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)对臭氧(ozone，O3)致哮喘小鼠气道反应性和气道重塑的影响。方法: 将15只SPF级C57BL/6雌性小鼠随机分为对照组、O3组和NaHS+O3组，每组5只。O3处理前0.5 h，对照组和O3组腹腔注射生理盐水，NaHS+O3组腹腔注射NaHS(H2S的供体)；O3组和NaHS+O3组隔天用O3处理，对照组则呼吸清洁空气。持续4周后无创测定小鼠的气道反应性，随后进行气管环张力测定，通过肺组织HE染色测定支气管基底膜周径(Pbm)和管壁总面积(Wat)并标准化衡量气道重塑程度，并行AB-PAS染色测定肺组织中杯状上皮细胞的变化情况以进一步评价气道重塑程度。结果: 与对照组相比，O3组小鼠的气道反应性显著增高；NaHS+O3组明显低于O3组，但与对照组相比差异无统计学显著性。与对照组相比，O3组小鼠在乙酰甲胆碱刺激时的气管收缩力显著加大；NaHS+O3组明显小于O3组。与对照组相比，O3组小鼠的支气管壁厚度明显加大；NaHS+O3组显著小于O3组但仍大于对照组。与对照组相比，O3组小鼠肺组织中杯状上皮细胞占气道上皮细胞总面积的百分比显著上升；NaHS+O3组显著低于O3组但仍高于对照组。结论: 外源性H2S对O3所致哮喘的气道高反应性和气道重塑有缓解与保护作用，有望为临床药物治疗哮喘提供新靶点。

[关键词]支气管哮喘； 硫化氢； 气道高反应性； 气道重塑； 臭氧

支气管哮喘(bronchial asthma)是以气道炎症、气道反应性增高和气道重塑为主要特征的慢性呼吸道疾病。大量国内外研究表明，臭氧(ozone，O3)作为一种强氧化性空气污染物，可诱导哮喘发病与病情加重[1-2]。硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是目前发现的第3个内源性气体信号分子。近年发现支气管哮喘患者血液和肺组织中内源性H2S均降低[3]，在鸡卵清蛋白致敏的哮喘小鼠研究也观察到同样现象，且H2S降低程度和呼气流量峰值成正比，与肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞成反比，提示内源性H2S可能参与哮喘的病理生理过程[4]。本研究通过O3诱导建立小鼠支气管哮喘模型，以硫氢化钠(sodium hydrosulfide，NaHS)为H2S供体，观察外源性H2S对哮喘小鼠气道反应性和气道重塑的影响，旨在进一步明确H2S能否成为临床治疗哮喘的药物。

材料和方法

1主要实验试剂及仪器

无创小动物肺功能仪(BUXCO)；臭氧发生器(广州海利集团有限公司)；臭氧检测仪(2B Techno-logies)；NaHS(Sigma)；AB-PAS染液(南京建成)。

2实验方法

2.1动物分组及模型制备SPF级C57BL/6雌性小鼠15只，6～8周龄，体重18～22 g。采用随机数字表将小鼠分为对照组、O3组、NaHS+O3组，每组5只，将小鼠饲养1周以适应环境。O3暴露前0.5 h，对照组、O3组腹腔注射生理盐水，NaHS+O3组腹腔注射0.14 μmol/kg的NaHS[5](用生理盐水溶成1 mmol/L的浓度再注射)；O3组和NaHS+O3组隔天用0.001‰的O3处理3 h，对照组则呼吸清洁空气，持续4周[6]。

2.2气道反应性的测定末次O3处理24 h后，使用BUXCO无创小动物肺功能仪检测C57BL/6小鼠的气道反应性。依次雾化吸入不同浓度(3.12、6.25、12.5、25和50 g/L)的氯化乙酰甲胆碱(methacholine，MCh)，测定相应浓度下增强的呼气间歇(enhanced pause，Penh)值。以吸入生理盐水(normal saline，NS)时的Penh值为基值，用Penh/NS(MCh 激发的Penh值/NS激发的Penh 值×100%)作为气道反应性统计指标来评价气道反应性。Penh/NS值越大，气道反应性越高；Penh/NS越小，气道反应性越低。

2.3气管环张力的测定解剖小鼠，摘取肺组织后，从颈部腹面正中切开皮肤分离出气管，自甲状软骨下剪取全部气管放入盛有37 ℃恒温Krebs-Henseleit液的平皿中，仔细剔除气管周围的结缔组织，将气管剪成3～5 mm左右的气管环。将气管环置于Krebs-Henseleit液浴槽中，调节温度为37 ℃，同时将支气管环上端连至张力换能器，逐次往浴槽加入Mch，使其终浓度分别为10-9、10-8、10-7、10-6和10-5g/L，用BL-420生物机能实验系统记录每次收缩产生的张力，每加入1次MCh并完成测量后，用恒温Krebs-Henseleit冲洗3次，每次冲洗10 min以上，以保证无MCh残留。

2.4肺组织切片HE染色将上述小鼠左肺下叶置于4%多聚甲醛溶液中固定，常规制备病理石蜡切片，HE染色后，镜下观察各组肺组织结构、炎性浸润、支气管壁有无增厚等情况，使用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0分别测量支气管基底膜周径(bronchial basement membrane circle diameter, Pbm)、支气管管壁总面积(total area of the wall, Wat)。 并用Pbm将测得的Wat标准化，用Wat/Pbm代表管壁厚度以衡量气道重塑程度。

2.5肺组织切片AB-PAS染色新鲜肺组织取材后，常规制备病理石蜡切片。切片经脱蜡后用蒸馏水洗2 min，随后用阿辛蓝(Alcian blue，AB)溶液染色20 min，蒸馏水洗3次。放入1 %高碘酸钠水溶液氧化10 min，再用过碘酸-雪夫(periodie acid- Schiff，PAS)液避光浸染20 min。倾去Schiff 液，流水冲洗10 min。后用苏木素染色液染核2 min，再用酸性乙醇分化液分化，蒸馏水洗2 min。用氨水溶液进行返蓝，蒸馏水洗3 min，逐级常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。在AB-PAS染色中，黏液物质被AB染色呈湖蓝色；中性黏液物质被PAS染色呈紫蓝色。镜下观察各组支气管腔，使用Image-Pro Plus 6.0系统定量分析蓝染阳性区域，并计算分泌黏液的杯状上皮细胞与气道上皮细胞数量比例以进一步评价气道重塑程度。

3统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，数据均以均数±标准差(mean±SD)表示。所有计量资料间的比较在确定方差齐性后采用单因素方差分析，以SNK法进行组间的两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1行为学观察

O3处理时，O3组小鼠表现为烦躁不安，呼吸急促，节律不齐，腹肌痉挛，大小便失禁；持续的O3应激后，部分小鼠出现喘息或哮鸣音。Control组和O3+NaHS组上述现象并不明显。

2气道反应性的变化

如图1所示，随着MCh的浓度增加，Penh/NS逐渐增大；在3.125与6.25 g/L浓度的Mch刺激时，对照组、O3组、O3+NaHS组的Penh/NS两两比较均无统计学差异(P>0.05)；用12.5、25和50 g/L浓度的MCh刺激时，O3组的Penh/NS与对照组相比差异均有统计学显著性(P<0.05)，O3+NaHS组的Penh/NS与O3组相比差异亦有统计学显著性(P<0.05)，但与对照组相比差异无统计学显著性。结果表明，O3组的气道反应性显著高于对照组，但O3+NaHS组的气道反应性明显低于O3组。

Figure 1.The changes of Penh/NS in the mice with different treatments. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsO3+NaHS group.

图1各组Penh/NS的变化情况

3气管收缩张力的变化

如图2所示，随着MCh的浓度增加，气管环收缩张力加大。在10-8、10-6和10-5g/L终浓度的MCh刺激时，O3组的收缩张力与对照组相比差异有统计学显著性(P<0.05)；在10-8、10-7、10-6和10-5g/L终浓度的MCh刺激时，O3+NaHS组的收缩张力与O3组对比差异均有统计学显著性(P<0.05)；结果表明，与对照组相比，O3组小鼠在MCh刺激时的气管收缩张力显著加大；NaHS+O3组明显低于O3组。由此可见，气道收缩张力的变化与气道反应性大体一致，进一步说明外源性H2S可以降低哮喘小鼠的气道反应性。

Figure 2.The changes of tracheal ring contraction tension stimulated with MCh in each group. Mean ±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsO3+NaHS group.

图2不同组对不同浓度乙酰甲胆碱刺激后气管环收缩张力的变化

4肺组织显微结构的改变

肺组织HE染色结果显示，对照组小鼠肺组织结构正常，未见炎症细胞浸润及平滑肌增生，支气管壁无改变；O3组小鼠肺组织大量炎症细胞浸润，支气管壁可见增厚，平滑肌细胞肥大增生，支气管上皮细胞有部分坏死阻塞支气管腔，肺泡上皮细胞亦可见坏死，气道重塑现象明显；NaHS+O3组小鼠可见炎症细胞数量较O3组有所减少，气道壁增厚不明显，平滑肌细胞无明显增生，坏死细胞亦减少，气道重塑现象比O3组有所缓解，见图3 。

5支气管壁厚度的变化

Image-Pro Plus 6.0软件分析结果显示，与对照组相比，O3组小鼠的支气管壁厚度明显加大(P<0.05)，重塑现象明显；NaHS+O3组小鼠的支气管壁厚度显著小于O3组(P<0.05)，重塑现象有所缓解但与对照组相比支气管壁仍增厚，见表1。

6气管腔中黏液与杯状上皮细胞

肺组织AB-PAS染色结果显示，与对照组相比，O3组的气道上皮细胞表面黏液增多，O3+NaHS组黏液比O3组有所减少。Image-Pro Plus 6.0软件定量分析显示，与对照组相比，O3组小鼠肺组织中杯状上皮细胞占气道上皮细胞总面积的百分比显著上升(P<0.05)；NaHS+O3组显著低于O3组(P<0.05)但仍高于对照组(P<0.05)。结果进一步表明，NaHS的干预可缓解O3所致的气道重塑现象，见图3、表1。

Figure 3.The morphological changes of the lung tissues in each group.

图3不同组的肺组织形态学观察

表1不同组支气管壁厚度和杯状上皮细胞占气道上皮细胞总面积百分比的比较

Table 1.The changes of the bronchial wall thickness and the proportion of goblet epithelial cells in the total area of airway epithelial cells in each group (%. Mean±SD.n=5)

GroupWat/PbmTheproportionofgobletepithelialcellsControl31.74±10.9816±3O372.33±8.43*33±5*O3+NaHS55.39±5.19*#19±3*#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsO3group.

讨论

支气管哮喘已严重影响了全球亿万人的健康，其患病率及死亡率逐年增加。预计到2025年，哮喘患者人数将有可能达到4亿。全球哮喘防治倡议资料2010年发布了中国大陆、台湾、香港、澳门等地哮喘人数为2 780万，平均临床哮喘患病率为2.1%。支气管哮喘导致患者反复出现喘息和呼吸困难等症状，其相关机制迄今尚未完全阐明[7]。近年环境中O3浓度逐年增高，已成为诱导哮喘发病与加重的重要致病因素之一[8]。大量临床资料与实验研究表明，O3可以作为一种无抗原性的氧化应激因子引起哮喘、慢性阻塞性肺病等一系列呼吸系统疾病[1]。O3能诱导气道中性粒细胞增高和炎症细胞浸润，加剧气道炎症程度，从而导致FEV1减少；还会导致气道过敏性介质5-HT生成增多，引起气道平滑肌张力增加[9]，并且通过氧化应激途径诱发气道黏液增多以及Muc5ac等黏蛋白表达，导致肺呼吸功能减弱；另外，O3还通过损伤上皮细胞与神经刺激等多个层面的效应通路导致气道反应性增高[4]。综上研究，O3可能通过上述途径启动和促发气道炎症反应与重塑，使气道狭窄，导致哮喘的发病与加重。本实验中，我们用0.001‰的O3反复刺激小鼠建立慢性哮喘模型，可观察到小鼠肺组织发生炎症细胞浸润，细胞坏死，气管壁杯状细胞增殖，气管壁增厚重塑，气道反应性增高，支气管环收缩张力增大，进一步表明O3可以引起气道损伤，收缩力增大，反应性增高等一系列哮喘的症状。

H2S是继NO和CO之后发现的第3个内源性气体信号分子，主要由气道和肺组织中的2种H2S生成酶——胱硫醚β合酶和胱硫醚γ合酶产生，对机体病理生理过程具有重要的调控作用，尤其与哮喘、肺损伤等呼吸疾病密切相关[10-11]。不少学者发现，内源性H2S减少的程度与哮喘的严重程度相关，提出内源性H2S的减少可以作为哮喘严重度及活动度的重要生物标志物[3-4, 12]。黄新莉等[10]使用NaHS作为外源性H2S的供体，观察到外源性的NaHS能通过下调细胞间黏附因子1以及抑制核因子κB通路而加快多形核白细胞凋亡，减少炎症细胞的集聚，起到降低肺损伤的作用；外源性H2S(NaHS)可通过减轻氧化应激、抑制炎症反应、降低小鼠的肺通透性来减轻高氧诱导的小鼠急性肺损伤[13]。在本实验中，我们提前半小时使用NaHS预处理O3诱导的慢性哮喘小鼠，观察到哮喘小鼠肺组织中炎症细胞浸润程度减低，气管壁增厚程度减弱，杯状细胞增生减少，气道反应性减低，气管收缩力减少，表明外源性H2S对哮喘炎症有缓解与治疗的积极作用。大量国内外研究表明，外源性H2S作为能自由穿透细胞膜的信息分子，能比传统的抗氧化剂更有效地抑制氧化应激、缓解炎症与降低肺的渗透性，并最终起到减轻肺与气道损伤、保护支气管与肺泡生长的作用[4, 14]。抗氧化作用可能是外源性H2S在本实验中抑制哮喘多种症状的原因。

综上所述，外源性H2S能一定程度减轻哮喘的气道高反应，降低气管收缩力，减少黏液分泌，缓解气道重塑，对臭氧导致的哮喘具有保护与缓解的积极作用。但在此实验中，我们并未从细胞和分子水平阐明外源性H2S缓解治疗哮喘的相关机制与通路，实验内容亦较为有限，接下来将进一步深入研究，以期为临床哮喘的药物治疗提供新的方向与治疗靶点。

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(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Effects of exogenous H2S on O3-induced airway hyperresponsiveness and airway remodeling in a mouse model of asthmaZHOU Li-fen1, LIN Qi-wang2, LIAO Li2, LIANG Zi-ming2, CHEN Qing-zi1, CHEN Ling-ling2, HUANG Jia-ting2, LI Jian hua1

(1DepartmentofBasicScience,2TheThirdClinicalDepartment,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China.E-mail:lijianh@hotmail.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of exogenous hydrogen sulfide (H2S) on ozone (O3)-induced airway hyperresponsiveness and airway remodeling in a mouse model of asthma. METHODS: Female SPF C57BL/6 mice were randomized as control group, O3group and NaHS+O3group. Half an hour before O3treatment, the mice in control group and O3group were intraperitoneally injected with normal saline, while the mice in NaHS+O3group were intraperitoneally injected with NaHS (H2S donor); then the mice in O3and NaHS+O3group were treated with O3, while the mice in control group breathed clean air. After 4 weeks, the airway responsiveness and tracheal ring tension were measured. The bronchial basement membrane circle diameter (Pbm) and the total area of the wall (Wat) were determined with HE staining and standardized to measure airway remodeling. The changes of goblet epithelial cells in the lung tissue were determined with AB-PAS staining. RESULTS: Airway tension of O3group was significantly higher than that in control group, but that in NaHS+O3group was obviously lower than that in O3group and had no significant difference compared with control group. Compared with control group, the tension of tracheal ring stimulated by methacholine in O3group increased significantly, but that in NaHS+O3group decreased obviously compared with O3group and had no significant change compared with control group. Compared with control group, bronchial wall thickness in O3group increased significantly, but that in NaHS+O3group decreased obviously compared with O3group and increased significantly compared with control group. Compared with control group, goblet epithelial cell proportion in the total area of airway epithelial cells in O3group increased significantly, but that in NaHS+O3group decreased compared with O3group and increased significantly compared with control group. CONCLUSION: Exogenous H2S reduces O3-induced airway hyperresponsiveness and airway remodeling, thus providing a new target for clinical drug treatment of asthma.

[KEY WORDS]Asthma; Hydrogen sulfide; Airway hyperresponsiveness; Airway remodeling; Ozone

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.026

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 020-37103061; E-mail: lijianh@hotmail.com

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81470205); 广州市属高校科研计划重点项目(No. 2012C043); 广东省医学科学技术研究基金资助项目(No. A2015157); 广州医科大学青年科研项目(No. 2014A01); 2014年度大学生创新创业训练计划

[收稿日期]2015- 09- 02[修回日期] 2015- 11- 05

[文章编号]1000- 4718(2016)02- 0347- 05