外周血Th17细胞对慢性阻塞性肺疾病症状严重程度及预后的评估价值*

汪　露，　江　涛

(重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆 400016)



外周血Th17细胞对慢性阻塞性肺疾病症状严重程度及预后的评估价值*

汪露，江涛△

(重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆 400016)

[摘要]目的： 观察Th17细胞水平与慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者症状严重程度及预后因素的相关性，以期探讨Th17细胞水平在判断COPD临床预后方面的可能价值。方法: 选取2013年5月～2014年12月我院就诊的110例COPD患者为研究对象，40例健康体检者为对照组。根据COPD全球倡议(GOLD)将COPD患者分为A组(低危、症状轻)、B组(低危、症状重)、C组(高危、症状轻)及D组(高危、症状重)，给予吸入性糖皮质激素/长效β2受体激动剂或吸入性糖皮质激素/长效β2受体激动剂+长效胆碱能药物治疗，收集患者治疗前及治疗3个月后相关临床资料，包括外周血Th17细胞比例、细胞因子(IL-17和IL-6)、慢性阻塞性肺疾病评估测试(CAT)评分、年龄、体重指数、肺功能指标及诊断前12个月COPD急性加重(AECOPD)次数，分析Th17细胞水平与其它临床特征间的相关性。结果: COPD患者外周血Th17细胞、IL-17及IL-6水平显著高于对照组(P<0.05)。随着COPD症状严重程度的增加，B、D组COPD患者外周血Th17细胞、细胞因子(IL-17和IL-6)水平及CAT评分显著高于A、C组患者(P<0.05)。单变量相关分析发现，治疗前B、D组外周血Th17细胞水平与CAT评分呈正相关(P<0.05)，而与FEV1、FEV1%Pred、FVC及FVC%Pred呈负相关(P<0.05)；A、C组外周血Th17细胞水平与CAT评分、FEV1、FEV1%Pred、FVC及FVC%Pred无明显相关性。治疗后外周血Th17细胞水平与CAT评分呈正相关(P<0.05)，而与FEV1、FEV1%Pred、FVC及FVC%Pred呈负相关(P<0.05)。结论: 外周血Th17细胞水平与COPD患者IL-17、IL-6、CAT评分及肺功能指标有较好的相关性，具有评估COPD患者症状严重程度及预后的潜在临床价值。

[关键词]Th17细胞； 慢性阻塞性肺疾病； 肺功能； 白细胞介素17

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstruction pulmonary disease，COPD)是各种炎症细胞参与的全身异常炎症反应性疾病，以不完全可逆的气流受限为主要特点[1]。其发病率高，预后差，严重威胁患者身体健康，同时给患者及社会带来沉重的经济负担。因此，如何早期预测其病情严重程度及预后，进而针对COPD患者进行个体化治疗，具有重要的临床意义。相关研究证实，中性粒细胞的募集与活化是COPD发生发展中的关键因素之一[2]。辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)是近些年发现的一类淋巴细胞亚群，在多种免疫及感染性疾病中起着重要的作用，其特异性分泌的细胞因子(IL-17)可诱导机体组织损伤，进而引发炎症反应[3]。Th17细胞是否与COPD的症状严重程度及预后有关，目前，相关研究尚未阐明。因此，本研究通过检测COPD患者外周血Th17及IL-17水平，并分析Th17细胞与肺功能指标的相关性，以期探讨Th17细胞在预测COPD患者症状严重程度及预后评价的临床价值。

材料和方法

1研究对象

选取2013年5月～2014年12月到我院呼吸内科就诊的COPD患者110例，男68例，女42例，年龄48岁～75岁，平均年龄63岁，所有患者均符合COPD诊断标准[4]。排除标准：合并有其它肺部疾病或感染者；存在免疫缺陷的患者；合并有其它系统疾病如心、肝、脑、肾等严重功能障碍；近1个月内使用糖皮质激素的患者；不愿意配合及不能交流的患者。同时选取我院门诊的健康体检者40例为正常对照组，其中男性25例，女性15例，年龄47岁～74岁，平均年龄62岁。COPD组与对照组间在性别、年龄方面的差异无统计学意义。本研究得到了医院伦理委员会的批准，并且所有患者均签署了知情同意书。

2主要仪器与试剂

流式细胞分析仪(BD)；RPMI-1640培养液及胎牛血清(Gibco)；高速离心机(Beckman)；肺功能仪(SensorMedics)；佛波酯、离子霉素及莫能菌素(Sigma)；抗人CD4-FITC单克隆抗体及抗人IL-17-PE单克隆抗体(eBioscience)；人细胞因子IL-17及IL-6 ELISA试剂盒(中国博士德公司)。

3方法

3.1肺功能检测对COPD患者进行常规肺功能检测，检测操作参照中华医学会呼吸病学分会肺功能检查操作规范进行。肺功能检测指标包括：第1 s用力呼气量(forced expiratory volume in one second，FEV1)、FEV1占预计值百分比(FEV1%Pred)、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)及FVC占预计值百分比(FVC%Pred)。

3.2COPD评估测试(COPD assessment test,CAT)评分方法CAT问卷主要包括 8 个问题(咳嗽、咳痰、胸闷、爬坡或上一层楼梯的感觉、家务活动、离家外出信心程度、睡眠和精力)。患者应根据自身情况，对上述每个项目做出相应评分，每个问题应根据病情从轻到重依次为0～5分。计算总分，CAT分值范围是0～40分。得分为0～10分的患者为COPD“轻微影响”，11～20者为“中等影响”，21～30分者为“严重影响”，31～40分者为“非常严重影响”。

3.3COPD患者分组收集COPD患者CAT评分、肺功能指标及诊断前12个月COPD急性加重(acute exacerbation of COPD,AECOPD)次数3个方面相关临床资料。根据慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD 2011)指南[5]，将他们分为A、B、C、D共4组，其中A组(29例)表示患者低危且症状轻；B组(30例)表示患者低危但症状重；C组(24例)表示患者高危但症状轻；D组(27例)表示高危且症状重。A、B组患者给予50 μg沙美特罗及500 μg丙酸氟替卡松治疗，一日2次； C、D组患者给予50 μg沙美特罗和500 μg丙酸氟替卡松，一日2次，加上18 μg噻托溴铵治疗，一日1次。各组均治疗3个月。

3.4外周血Th17细胞检测收集COPD组治疗前后及对照组清晨空腹静脉血3 mL，经肝素抗凝及加入等体积淋巴细胞分离液后离心，1 500 r/min 15 min，得到外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)悬液，采用血球计数板计算PBMC数量。12孔板培养PBMC，每孔加入RPMI-1640培养基1 mL，佛波酯(50 μg/L)、离子霉素(1 mg/L)及莫能菌素(0.7 mg/L)吹打混匀，孵育4 h。加入抗人CD4单抗20 μL，室温避光孵育20 min。再通过加入染色缓冲液2 mL及抗IL-17单抗20 μL，室温孵育15 min，此后离心1 500 r/min 10 min，弃上清，加入染色固定液1 mL，等待上机检测。

3.5ELISA检测血浆IL-6和IL-17的含量采用ELISA法检测COPD组治疗前后及对照组外周血IL-6和IL-17水平，整个操作按试剂盒说明步骤进行。简要操作步骤如下：取出酶标板，确定其酶标板数目，分别加入标准品和待测样本，在室温条件下，孵育1 h。PBS洗板3次，然后加入酶标工作液100 μL，室温孵育1 h。再次PBS洗板3次，加入显色剂A液100 μL和显色剂B液100 μL，室温避光条件下，孵育30 min。PBS洗板3次，加入终止液100 μL后，在酶标仪上测量各组A450值。绘制其标准曲线，计算各组样本IL-6和IL-17的水平。

4统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行数据分析及处理。计量资料数据以均值±标准差(mean±SD)表示，各组间差异性比较进行方差齐性检验。两组间比较采用t检验，而多组间比较运用单因素方差分析，相关分析采用Spearman相关法。以P<0.05为差异有统计学意义。运用Graphpad软件做ROC曲线，计算ROC曲线下面积及最佳工作点。

结果

1COPD组与对照组外周血Th17及细胞因子水平

与正常对照组相比，COPD组患者外周血Th17细胞及IL-17、IL-6显著高于对照组(P<0.05),见图1、表1。

Figure 1.The Th17 cell levels in the 2 groups were measured by flow cytometry.

图1流式细胞术检测2组间Th17细胞比例

表12组外周血Th17及细胞因子水平

Table 1.The levels of Th17 and cytokines in the 2 groups (Mean±SD)

GroupnTh17(%)IL-17(ng/L)IL-6(ng/L)Control401.1±0.510.7±2.85.8±1.6COPD1106.9±1.6*39.4±7.2*18.9±3.2*

*P<0.05vscontrol group.

2不同COPD危重组间外周血Th17、细胞因子水平及肺功能的比较

B、D组COPD患者吸烟指数较A、C组明显增高(P<0.05)。随着症状严重程度的增加，B、D组COPD患者外周血Th17细胞、细胞因子(IL-17和IL-6)水平及CAT评分显著高于A、C组患者(P<0.05)。B、C、D组患者肺功能指标FEV1、FEV1%Pred、FVC及FVC%Pred较A组降低(P<0.05)。C组、D组AECOPD次数显著较A、B组增加(P<0.05)。各组间在性别、年龄及体重指数方面差异无统计学意义，见表2。

3治疗前后COPD患者外周血Th17、细胞因子水平、CAT评分及肺功能比较

与治疗前相比，COPD患者治疗后外周血Th17细胞、IL-17、IL-6和CAT评分明显降低(P<0.05)。与治疗前相比，COPD患者治疗后肺功能指标FEV1、FEV1%Pred、FVC及FVC%Pred明显较治疗前改善(P<0.05)，见表3。

4相关性分析

处周血Th17细胞水平与各临床指标之间的相关性分析结果见表4。

表2　不同COPD危重组患者的临床特征

*P<0.05vsgroup A.

表3COPD患者治疗前后相关临床特征比较

Table 3.The clinical characteristics of COPD patients before and after treatment

ItemBeforetreatmentAftertreatmentTh17(%)6.9±1.63.2±0.5*IL-17(ng/L)39.4±7.229.2±6.9*IL-6(ng/L)18.9±3.211.7±2.8*CATscore14.3±3.77.2±1.3*FEV1(V/L)1.5±0.32.0±0.4*FEV1%Pred66.8±8.680.4±9.0*FVC(V/L)2.5±0.33.4±0.4*FVC%Pred83.4±5.595.3±6.8*

*P<0.05vsbefore treatment.

表4外周血Th17细胞水平与各临床指标之间的相关性

Table 4.The correlation between peripheral Th17 cell level and clinical indicators

ItemTh17(%)beforetreatmentTh17(%)aftertreatmentrPrPIL-17(ng/L)0.6820.0120.8520.005IL-6(ng/L)0.7230.0090.9420.003CATscore0.4720.0280.5230.015FEV1(V/L)-0.3640.023-0.4820.012FEV1%Pred-0.5230.011-0.5730.011FVC(V/L)-0.4620.013-0.6960.008FVC%Pred-0.3150.025-0.4340.014

5外周血Th17细胞水平对COPD患者症状严重程度诊断的ROC曲线分析

通过ROC曲线分析发现外周血Th17细胞水平的曲线下面积(AUC)为0.871，其最佳工作点(OOP)为7.1 %，提示外周血Th17细胞比例>7.1 %，此时判断COPD症状严重程度的精确率较高(敏感性为81.42%，特异性为87.50%)，见图2。

Figure 2.The ROC curves of peripheral Th17 cell level.

图2外周血Th17细胞水平的ROC曲线

讨论

COPD主要表现为不完全性可逆气流受限，病情常进行性加重，严重威胁患者身体健康。目前，COPD的发病率及死亡率均较高，虽然其确切的发病机制仍不太清楚，但大量的研究已显示，反复的气道慢性炎症在COPD的发生发展过程中起着重要的作用[6]。Th17是一类近些年来发现的淋巴细胞亚群，其主要分泌IL-17，发挥相应的效应。相关研究证实，在自身免疫性疾病及炎症性疾病中，特别是脓毒症患者中，其外周血中Th17细胞比例及IL-17明显高于健康对照者，并且随着疾病严重程度的加重，Th17细胞数量及IL-17水平也明显增加[7]。可见，Th17细胞的活化是促进炎症性疾病发生发展的重要环节之一。已有研究显示，COPD患者外周血中Th17细胞数量及IL-17水平较正常对照者显著升高[8]，提示Th17在COPD的发病过程中起着重要的作用，但是否Th17与COPD的症状严重程度及预后有关，目前相关研究尚未阐明。针对COPD患者寻找一项指标，有效的评估其症状严重程度及预后，对于临床进一步干预治疗具有重要的意义。在本研究中，通过检测COPD患者外周血Th17及IL-17水平，结果发现与以往研究报道一致，COPD患者外周血Th17及IL-17水平较正常对照者明显升高。进一步根据COPD患者CAT评分、肺功能指标及诊断前12个月AECOPD次数3个方面对其症状严重程度进行分组，结果发现，随着症状严重程度的增加，其外周血Th17、IL-17及IL-6水平也明显增加。相关分析显示，COPD患者症状严重组其外周血Th17细胞比例与肺功能呈负相关，而与CAT评分呈正相关，说明COPD外周血Th17细胞比例越高，肺功能越差，而相应的CAT评分越高。通气功能及CAT评分是反映COPD患者临床预后的重要参考指标[9]。通过进一步做外周血Th17细胞比例ROC曲线分析判断COPD症状严重程度，其曲线下面积较大(>0.85)，可作为判断症状严重程度的有效指标，其中，Th17细胞比例>7.1 %时对COPD症状严重度的判断精确率较高。同时本研究通过给予各组COPD患者相应治疗后，肺功能较治疗前明显改善，CAT评分明显降低，提示患者的临床预后较好。同时进一步检测治疗后外周血Th17及IL-17水平，结果显示，COPD患者治疗后其外周血Th17及IL-17明显较治疗前降低，表明外周血Th17可用于评估COPD患者治疗效果，判断其预后。相关研究显示，抑制体内Th17细胞及其分泌的IL-17水平，可以明显降低炎症反应，改善炎症性疾病患者预后[10]。针对COPD患者，通过检测外周血Th17细胞水平，其不仅可作为评判症状严重程度及预后的有效指标，还可能为其治疗提供新的靶点。

综上所述，COPD患者外周血Th17细胞水平随着病情的发展呈现明显升高趋势，能有效地反映症状的严重程度，同时对预后也有一定的参考价值。因此，在临床工作中，可通过检测Th17细胞水平对COPD患者症状严重程度及预后进行评估，同时为进一步的个体化治疗提供依据。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Diagnostic value of Th17 cells in symptom severity and prognosis of chronic obstructive pulmonary diseaseWANG Lu, JIANG Tao

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:jiangtaocq01@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To observed the correlation between Th17 cell level and the symptom severity and prognostic factors of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and to explore the clinical application value of Th17 cell level in assessing the prognosis of patients with COPD. METHODS: The patients with diagnosed COPD (n=110) in our hospital during May 2013 to December 2014, and 40 healthy subjects were enrolled in the study. According to the Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD), the COPD patients were divided into group A (low risk, less symptoms), group B (low risk, more symptoms), group C (high risk, less symptoms) and group D (high risk, more symptoms), which were given inhaled corticosteroid/long-acting β2agonist or corticosteroid/long-acting β2agonist+long-acting antimuscarinic agent treatment for 3 months. The proportion of Th17 cells, cytokines (IL-17 and IL-6), the COPD assessment test (CAT) score, age, body mass index, pulmonary function and the times of acute exacerbation of COPD in previous 1 year were observed before and after treatment. The correlation analysis between the level of Th17 cells and other clinical characteristics was performed. RESULTS: Th17 cell, IL-17 and IL-6 levels in COPD group were significantly higher than those in control group (P<0.05). With the increase in the severity of COPD symptoms, Th17 cells, cytokines (IL-17 and IL-6) and CAT score in groups B and D were significantly higher than those in groups A and C (P<0.05). The univariate analysis showed that the levels of Th17 cells in groups B and D before treatment were positively correlated with the CAT score (P<0.05), which were negatively correlated with FEV1, FEV1% Pred, FVC and FVC% Pred. The levels of Th17 cells were not correlated with the CAT score, FEV1, FEV1% Pred, FVC and FVC% Pred in groups A and C. The levels of Th17 cells after treatment were positively correlated with the CAT score, which were negatively correlated with FEV1, FEV1% Pred, FVC and FVC% Pred (P<0.05). CONCLUSION: The peripheral Th17 cell level has a good correlation with IL-17, IL-6, CAT score and pulmonary function in COPD patients, suggesting a potential value to predict the symptom severity and prognosis of COPD.

[KEY WORDS]Th17 cells; Chronic obstructive pulmonary disease; Pulmonary function; Interleukin-17

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.02.014

[中图分类号]R563； R363

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 023-89012704; E-mail: jiangtaocq01@163.com

*[基金项目]国家临床重点专科专项经费资助课题(No. 2012-649)

[收稿日期]2015- 08- 03[修回日期] 2015- 10- 19

[文章编号]1000- 4718(2016)02- 0273- 05