失代偿期乙型肝炎肝硬化患者骨髓间充质干细胞对自体外周血淋巴细胞及调节性T细胞亚群增殖的影响

张　笛　晋琼玉

(四川省医学科学院　四川省人民医院消化内科，四川　成都　610072)



失代偿期乙型肝炎肝硬化患者骨髓间充质干细胞对自体外周血淋巴细胞及调节性T细胞亚群增殖的影响

张笛晋琼玉1

(四川省医学科学院四川省人民医院消化内科，四川成都610072)

〔摘要〕目的研究乙型肝炎肝硬化失代偿期患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)对其外周血中淋巴细胞、调节性T细胞亚群(Tregs)增殖的影响。方法12例乙型肝炎肝硬化失代偿期患者骨髓分离培养出间充质干细胞，采用倒置显微镜观察培养后的贴壁细胞形态、采用流式细胞仪技术观察间充质细胞免疫表型；在植物血凝素(PHA)刺激下、自体血清作为培养基，实施BMSCs和患者自体外周血淋巴细胞共培养，分为A组(BMSCs+淋巴细胞+PHA接触培养)、B组(BMSCs+淋巴细胞+PHA非接触培养)、C组(淋巴细胞+PHA培养)、D组(淋巴细胞)，均72 h后观察BMSCs对外周血淋巴细胞增殖及Tregs细胞表达的影响。结果流式细胞仪分析结果显示：培养3代后的间充质干细胞主要高表达T细胞亚群(Tregs)中的CD44(95.26%)、CD29(92.18%)，低表达CD34(1.27%)、CD25(1.33%)。 C组淋巴细胞增殖率显著高于A、B、D组(P<0.05),A、B两组显著高于D组(P<0.05),但A、B两组差异无统计学意义(P>0.05)。 A、B、C组Tregs细胞表达率显著高于D组(P<0.05),A、B两组显著高于C组(P<0.05),A、B两组差异无统计学意义(P>0.05)。结论乙型肝炎肝硬化失代偿期患者BMSCs对其外周血中淋巴细胞增殖具有抑制作用、同时调上调T细胞亚群表达，BMSCs可能具有免疫抑制作用。

〔关键词〕乙型肝炎肝硬化；失代偿期；骨髓间充质干细胞；淋巴细胞；调节性T细胞

1四川省郫县人民医院内科

第一作者：张笛(1980-)，女，主治医师，主要从事慢性肝病研究。

充质干细胞为中胚层或者外胚层来源的具有多向分化潜能的干细胞，在部分诱导因子的刺激下可以分化为脂肪、肌肉、骨骼及部分内脏器官组织，骨髓间充质干细胞(BMSCs)为最早发现的多向分化潜能干细胞，具有自我增殖、免疫调节、促进造血及促进干细胞植入的作用〔1,2〕，近年来部分学者通过BMSCs治疗失代偿期肝硬化，并认为BMSCs可以通过在肝脏组织细胞损伤部位重新分化增殖为正常干细胞，进而促进肝脏新生组织细胞再生，改善患者的临床症状〔3,4〕。BMSCs对于局部肝脏细胞免疫抑制及抗炎作用可能发挥了较为重要的作用，本文拟通过了解乙肝肝硬化失代偿期患者BMSCs对其外周血中淋巴细胞、调节性T细胞亚群(Tregs)增殖的影响，进一步了解BMSCs对乙肝肝硬化失代偿期患者治疗的作用机制。

1资料与方法

1.1一般资料2014年3~12月12例乙肝肝硬化失代偿期患者，男8例，女4例，年龄52～71岁，平均(64.2±8.7)岁，肝功能Child-Pugh评分(12.6±2.3)分，丙氨酸氨基转移酶(ALT)(33.6±21.5)U/L，总胆红素(TBIL)(42.2±22.7)μmol/L。符合2010 年版“慢性乙型肝炎防治指南”中关于失代偿期乙型肝炎肝硬化的诊断标准；近期未使用糖皮质激素、免疫抑制剂等药物；均知情同意。

1.2实验仪器与药品兔抗CD44、CD29、CD34及CD25抗体均购自南京凯基生物科技有限公司，间充质干细胞及淋巴细胞分离液购自江苏太生生物科技有限公司。

1.3检测方法卵巢细胞株培养至融合度为50%时，接种于干细胞培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，孵育24 h后用胰蛋白酶消化液〔不含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化细胞，离心收集细胞后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞1次(2 000 r/min，5 min)，加入CD44、CD29、CD34及CD25抗体，室温孵育20 min，生理盐水洗涤3次，每次5 min，流式细胞仪上机检测各标记抗体细胞群分布。

1.4统计学方法应用SAS9.0软件进行单因素方差分析，t检验。

2结果

2.1BMSCs培养结果鉴定均成功分离培养出原代BMSCs，培养至第3代，其纯度可达到95%，BMSCs细胞多于12 h后开始贴壁生长，倒置显微镜下观察可见BMSCs呈贴壁梭形、多角，呈平行排列或呈漩涡状，见图1。培养3代后的BMSCs主要高表达Tregs中的CD44(95.26%)、CD29(92.18%)，低表达

CD34(1.27%)、CD25(1.33%)。见图2。

2.2BMSCs对外周血淋巴细胞增殖的影响作用C组淋巴细胞增殖率(63.18%±8.14%)显著高于A(32.57%±6.84%)、B(34.72%±5.25%)、D组(5.26%±1.74%)(F=28.93，P<0.001),A、B两组显著高于D组(P<0.05),A、B两组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3BMSCs对外周血Tregs细胞亚群的影响作用A、B、C组Tregs细胞表达率(48.05%±9.22%、46.25%±7.20%、21.47%±5.50%)显著高于D组(4.26%±1.52%)(F=21.096，P<0.01),A、B两组显著高于C组(P<0.05),A、B两组差异无统计学意义(P>0.05)。

图1　BMSCs原代培养(倒置显微镜，×40)

图2　流式细胞仪检测BMSCs表面抗原分子

3讨论

肝硬化晚期可表现为腹水、低蛋白血症、凝血功能障碍及较为严重的门脉高压症状，部分患者可因肝性脑病的发生而引起病死率的上升〔5〕。近年来BMSCs已广泛应用于治疗失代偿期肝硬化，考虑BMSCs可以通过抑制IL-6及肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎症趋化因子进而抑制级联式的炎症反应，并通过抑制Toll样受体四种亚型进而抑制其进入干细胞线粒体导致的细胞凋亡，另外部分学者认为BMSCs可对金属基质蛋白酶(MMP)-9及MMP-6的生成调节，进而促进细胞外纤维成分的降解，减轻纤维化的肝脏组织〔6,7〕。但迄今为止，对于BMSCs对免疫调节机制的探讨较少，仅有部分学者通过建立动物模型进而发现BMSCs可以通过调节CD4+CD25+T淋巴细胞及TH1/TH2淋巴细胞平衡，进而参与失代偿期肝硬化的治疗过程〔8〕，Yu等〔9〕通过雌激素刺激BMSCs治疗的肝硬化组织后发现，其细胞内Toll样受体3的表达明显上调，并认为雌激素可能通过抑制雌激素受体(ER)/Cyclin信号通路进而参与抑制IL-6炎症介导的级联炎症反应。

部分学者认为在失代偿性肝硬化的发生发展过程中，D44+CD29+Treg干细胞呈现出了降低的趋势，但并无明显的相关实验室指标如血清白蛋白及凝血功能指标的依赖性〔10〕，本研究发现，培养3代后的间充质干细胞主要高表达Tregs中的CD44+CD29+，证实了MSCs可能通过逆转或者恢复CD44+CD29+Treg淋巴细胞进而促进干细胞再生，在BMSCs的刺激下淋巴细胞的增殖能力并不依赖植物血凝素的影响，贴壁或者不贴壁生长均不能显著影响淋巴细胞的增殖效能，考虑BMSCs对于淋巴细胞增殖的影响可能通过可溶性细胞因子如可溶性雌激素末端磷酸化产物而起效〔11〕，而无BMSCs刺激的淋巴细胞增殖率明显增高，提示了BMSCs对于淋巴细胞增殖率的抑制作用，这与Xu等〔12〕认为的BMSCs通过抑制除了抗原提呈细胞(APC)在内的多数淋巴细胞增殖进而促进局部细胞再生观点较为相似。另外，BMSCs对外周血Tregs细胞亚群的影响较为明显，提示BMSCs对于Tregs细胞表达的上调作用，Xu等〔12〕认为转化生长因子(TGF)-β及IL-10的调节作用参与免疫抑制过程，Jang等〔10〕通过探讨35例肝硬化患者的临床资料后也认为，Tregs细胞表达阳性率伴随了肝硬化门静脉高压期发展的全过程。

综上所述，BMSCs对于乙肝肝硬化失代偿期患者外周血中淋巴细胞增殖具有抑制作用，同时可上调Tregs细胞表达阳性率，可能进而发挥其促进肝细胞再生及缓解肝纤维化的作用。本次研究的例数较少，需进一步扩大研究样本。

4参考文献

1潘修成，杨帆，陈明，等.替比夫定对慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞动态变化的影响及其临床意义〔J〕.中华肝脏病杂志,2012;16(12):885-8.

2卿克勤，杨朝国，刘蓉.慢性乙型肝炎患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞变化水平及其与抗病毒疗效的关系〔J〕.检验医学,2013;33(9):811-4.

3郭春辉，韩兰秀，万美容，等.失代偿期乙肝肝硬化患者的骨髓间充质干细胞的免疫调节作用〔J〕.中华实验和临床病毒学杂志,2014;28(4):262-4.

4李晓峰，赵劲民，苏伟，等.大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定〔J〕.中国组织工程研究与临床康复,2011;15(10):1721-5.

5姜华，高建鹏.骨髓间充质干细胞治疗肝脏疾病研究进展〔J〕.实用肝脏病杂志,2015;34(2):217-20.

6王震凯，吴琳，魏娟，等.自体骨髓间充质干细胞移植治疗难治性肝硬化腹水患者的临床疗效观察〔J〕.中华细胞与干细胞杂志(电子版),2014;22(4):227-31.

7王立，韩钦，孔芳，等.骨髓间充质干细胞对原发性胆汁性肝硬化患者的免疫调节作用〔J〕.中华风湿病学杂志,2014；18(12):798-801.

8胡昆鹏，刘波，姚志成，等.骨髓间充质干细胞与肝星状细胞共培养后凋亡相关基因的改变〔J〕.中国组织工程研究,2014;43(28):4444-9.

9Yu SH,Liu LJ,Lv B,etal.Inhibition of bleomycin-induced pulmonary fibrosis by bone marrow-derived mesenchymal stem cells might be mediated by decreasing MMP9,TIMP-1,INF-gamma and TGF-beta〔J〕.Cell Biochem Funct,2015;22(4):227-31.

10Jang YO,Jun BG,Baik SK,etal.Inhibition of hepatic stellate cells by bone marrow-derived mesenchymal stem cells in hepatic fibrosis〔J〕.Clin Mol Hepatol,2015;21(2):141-9.

11Guo CH,Han LX,Wan MR,etal.Immunomodulatory effect of bone marrow mesenchymal stem cells on T lymphocytes in patients with decompensated liver cirrhosis〔J〕.Genet Mol Res,2015;14(2):7039-46.

12Xu J,Li L,Xiong J,etal.Cyclophosphamide combined with bone marrow mesenchymal stromal cells protects against bleomycin-induced lung fibrosis in mice〔J〕.Ann Clin Lab Sci,2015;45(3):292-300.

〔2014-11-23修回〕

(编辑苑云杰)

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on proliferation and Tregs subsets of peripheral blood lymphocytes in patients with chronic hepatitis B cirrhosis

ZHANG Di,JIN Qiong-Yu.

Department of Gastroenterology，Sichuan Academy of Medical Science & Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，Sichuan，China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)on the value of T cells in the peripheral blood of patients with cirrhosis of liver cirrhosis.Methods12 patients with hepatitis B liver cirrhosis decompensation period were selected,and their BMSCs were separated and cultured.Adherent cells morphology were observed by inverted microscope,immunophenotype of BMSCs were detected by flow cytometry instrument technique.BMSCs and autologous peripheral blood lymphocytes were co-cultured in autologous serum and phytohemagglutinin(PHA)stimulation.Groups were divided into:group A(BMSCs+ lymphocytes +PHA culture in contact),group B(BMSCs+ lymphocytes +PHA culture non-contact),group C(lymphocytes +PHA culture),and group D(lymphocytes).Effects of BMSCs on peripheral blood lymphocyte proliferation and Tregs were observed after cultured for 72 h.ResultsFlow cytometric analysis results showed that the culture after 3 generations of mesenchymal stem cells mainly highly expressed T cell subsets(Tregs)of CD44(95.26%),CD29-(92.18%)and lowly expressed CD34(1.27%),CD25(1.33%).Lymphocyte proliferation rate in Group C was significantly higher than that of group A,B and D(P<0.05).Lymphocyte proliferation rate in Group A,B was significantly higher than that of group D(P<0.05).There was no significant difference in lymphocyte proliferation rate between group A and B(P>0.05).Tregs expression rate in group A,B and C was significantly higher than that of group D(P<0.05),Tregs expression rate in group A,B was significantly higher than that of group C(P<0.05).There was no significant difference in Tregs expression rate between group A and B(P>0.05).ConclusionsBMSCs in the patients with chronic hepatitis B cirrhosis decompensation period have inhibition effect on the proliferation of peripheral blood,and could up-regulate the expression of T cells in the same time.BMSCs might have immunosuppressive effect.

【Key words】Hepatitis B cirrhosis;Decompensation;Bone marrow mesenchymal stem cells;Lymphocytes;Regulatory T cells

基金项目：国家自然科学基金项目(No.50063753)；四川省卫生厅基金项目(No.110184)

〔中图分类号〕R575.2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)04-0792-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.009