补肾健脾、解毒利咽法对IgA肾病模型大鼠Th1/Th2的影响

张冬梅　王银萍　王宏安　张洪宝　张守琳

(长春中医药大学附属医院，吉林　长春　130021)



补肾健脾、解毒利咽法对IgA肾病模型大鼠Th1/Th2的影响

张冬梅王银萍王宏安张洪宝张守琳

(长春中医药大学附属医院，吉林长春130021)

〔摘要〕目的探讨补肾健脾，解毒利咽法对IgA肾病(IgAN)模型大鼠Th1/Th2的影响。方法选取体重(180±20)g的SD雄性大鼠72只，随机分为空白组、模型组、雷公藤多甙片组(对照组)、补肾健脾、解毒利咽中药低、中、高剂量组，参照陆慧渝等报道的方法制备动物模型，采用荧光半定量法检测大鼠肾组织系膜区IgA沉积情况，采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组大鼠血清中细胞因子白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10、干扰素(INF)-γ的表达水平。结果造模后大鼠出现不同程度食欲差、毛色杂乱，体重下降，肾组织系膜区出现IgA沉积；给药后，各治疗组大鼠IgA沉积有所减轻；与空白组比较，模型组大鼠血清IL-2、INF-γ的水平明显下降(P<0.05)，IL-4、IL-10的水平明显升高(P<0.05)，Th1/Th2比值出现漂移；与模型组比较，各治疗组血清IL-2、INF-γ的水平明显上调(P<0.05)，IL-4、IL-10的水平明显下调(P<0.05)，Th1/Th2漂移改善，其中中药组改善程度与对照组相比无明显差异(P>0.05)。结论IgAN模型大鼠细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ表达紊乱，Th1/Th2出现漂移；补肾健脾、解毒利咽法能够调整细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ表达水平，纠正Th1/Th2比值漂移。

〔关键词〕补肾健脾；解毒利咽法；IgA肾病；细胞因子；Th1/Th2

第一作者：张冬梅(1985-)，女，硕士，主治医师，主要从事中医内科学的研究。

IgA肾病(IgAN)在中国发病率为45%~50%〔1〕，其中约15%~40%的IgAN患者在10年后将会进展为终末期肾病(EsRD)〔2，3〕。任继学教授认为本病的病机核心为肾虚脾亏，而咽部感染是发病之源，提出以补肾健脾、解毒利咽法治疗本病，临床应用40年，疗效显著。本文旨在进一步探讨该疗法的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物选取体重(180±20)g的SD雄性大鼠72只(由吉林大学白求恩医学院动物实验室提供)，全部大鼠尿红细胞计数及尿蛋白定性试验均为阴性。

1.2实验药品雷公藤多甙片：上海复旦复华有限公司生产，批号：国药准字Z31020415；补肾健脾，解毒利咽方药：生地黄20 g，生黄芪20 g，山萸肉20 g，山药20 g，生茅根50 g，土茯苓30 g，生蒲黄15 g(包煎)，马勃15 g，金荞麦30 g，紫荆皮15 g，木蝴蝶15 g，甘草5 g。由长春中医药大学附属医院中药房统一煎制。

1.3试剂及仪器荧光显微镜TXM-500C，上海天省仪器有限公司；全自动酶标仪318C，上海昨非实验室设备有限公司。白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10、γ-干扰素(INF-γ)、酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒，由上海信裕生物科技有限公司提供；牛血清白蛋白由美国sigma公司提供；荧光素标记兔抗大鼠IgA抗体，北京博奥森生物技术有限公司。

1.4动物模型制备大鼠购买后饲养1 w，以适应环境。参照陆慧瑜等〔4〕报道的方法制备动物模型，至第9周每组各选取2只取肾组织，利用荧光半定量(荧光半定量标准参照国内外通用的五级法分级〔5〕)的方法判断大鼠肾组织系膜区IgA的沉积强度，验证模型是否成功，整个过程密切观察大鼠的一般活动。

1.5动物分组与给药将选取的大鼠用随机分组方式分为6组，每组12只，分别为模型组、空白组、雷公藤多甙片组(对照组)、补肾健脾、解毒利咽中药低、高剂量组。

空白组：自造模成功起，给予4 ml·kg-1·d-1生理盐水灌胃，1次/d，持续至12 w末；模型组：自第9周起，给予生理盐水4 ml·kg-1·d-1灌胃，1次/d，至12 w末；对照组：自造模成功后起，给予雷公藤多甙片6 mg·kg-1·d-1，灌胃1次/d，持续至12 w末；中药低剂量组：自造模成功后起，给予中药汤剂4 ml·kg-1·d-1灌胃，含生药量8 g/kg，灌胃1次/d，持续至12 w末；中药中剂量组：自造模成功后起，给予中药汤剂4 ml·kg-1·d-1灌胃，含生药量16 g/kg，灌胃1次/d，持续至12 w末；中药高剂量组：自造模成功后起，中药汤剂4 ml·kg-1·d-1灌胃，含生药量32 g/kg，灌胃1次/d，持续至12 w末。

1.6观察指标观察大鼠的一般状态；造模后第9周每组取2只大鼠，采用荧光半定量检测大鼠肾组织IgA沉积情况；采用ELISA法检测大鼠血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的表达水平。

1.7统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1一般状况实验过程中大鼠共死亡9只，造模后大鼠出现不同程度食欲差、毛色杂乱、腹泻、体重下降，给予治疗后各治疗组大鼠食欲及毛色有所改善，体重增长，其中以中药组体重增长较快。

2.2用药后各组大鼠免疫荧光沉积情况空白组大鼠肾小球系膜区和毛细血管壁未见IgA沉积(-)，模型组大鼠有很强的弥漫性团块状IgA沉积()，对照组及中药低、中、高剂量组IgA沉积程度不同，但强度较模型组比较明显减轻，见图1。

2.3血清中IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的表达情况模型组IL-2、INF-γ的水平较空白组下降(P<0.05)，IL-4、IL-10的水平较空白组升高(P<0.05)。经过补肾健脾、解毒利咽法中药治疗后，与模型组比较，各中药组IL-2、INF-γ的水平上调，IL-4、IL-10的水平下调，纠正了Th1/Th2失衡状态，其中中药组改善程度与对照组相比无明显差异(P>0.05)。见表1。

图1　各组大鼠免疫荧光沉积情况

组别IL-2(ng/ml)IL-4(pg/ml)IL-10(μg/L)INF-γ(pg/ml)INF-γ/IL-4空白组4.84±0.89105.11±10.9851.48±8.97789.51±20.947.12±0.54模型组2.45±1.412)159.23±11.142)81.64±9.152)453.36±13.612)4.08±0.21对照组3.49±0.671)106.32±10.321)53.16±8.311)731.67±19.361)7.12±0.54中药低剂量组3.41±1.061)107.56±10.781)56.42±9.111)792.72±18.461)8.16±0.33中药中剂量组4.46±3.271)106.37±9.681)54.72±9.631)823.41±15.751)8.14±0.24中药高剂量组3.84±1.101)106.30±9.981)58.47±9.481)814.26±15.731)7.92±0.51

与模型组比较:1)P<0.05;与空白组比较:2)P<0.05

3讨论

IgAN的重要发病机制是以IgA或以IgA为主的免疫复合物沉积。目前已经得到公认，T辅助细胞分为Th1细胞和Th2细胞亚群，其中Th1细胞主要分泌INF-γ及IL-2等细胞因子介导细胞免疫应答，而Th2细胞主要分泌IL-4及IL-10等细胞因子介导体液免疫应答。Th1和Th2细胞因子会分别诱导Th0细胞向各自细胞亚群分化并促进其细胞激活，而在正常情况下，Th细胞亚群之间是相互制约的，各类细胞因子对另一类细胞亚群的产生及活化都存在抑制作用，使Th1及Th2两类细胞因子相互影响，相互制约，从而在免疫应答中发挥调节作用〔6,7〕。因此，Th1及Th2亚群应保持平衡，其发生失衡与免疫性肾炎的发生密切相关。Nogaki等〔8,9〕在小鼠中发现联合应用IL-4和IL-5等Th2细胞因子能够诱导B细胞产生异常糖基化的IgA。既往研究也表明，IgAN患者活动期Th1/Th2失衡，即INF-γ下调、IL-4及IL-10上调，缓解后则Th1/Th2失衡纠正，即INF-γ上调、IL-4及IL-10下调，提示IgAN存在Th1/Th2失衡〔10〕。因此，能否运用纠正Th1/Th2失衡的方法来治疗IgAN是值得进一步探索的，而直接采用输注外源性Th1细胞因子及Th2细胞因子来纠正Th1/Th2失衡，目前还存在很大的困难，而中药对免疫系统具有重要的调节作用。

国医大师任继学教授认为本病的病机核心为肾虚脾亏，而邪毒蕴结咽喉是本病发病的使动因素。正如《灵枢·经脉篇》指出“肾足少阴之脉，……其直者从肾上贯肝膈，入肺中，循喉咙，挟舌本”。可见咽喉属肾络肺，为外邪出入之门户，邪毒从口鼻而入，盘踞于咽喉，形成乳蛾，从气血之道侵犯于肾，形成伏邪，久而为毒，居于肾宫，形成咽喉→肺→肾的恶性循环。因此，肾炎的发生与复发以及病情的加重和咽喉密切相关。因此任老提出补肾健脾、解毒利咽之大法。综上，补肾健脾、解毒利咽法治疗IgAN具有较好的临床疗效，考虑与调节细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ的表达水平、纠正Th1/Th2失衡的作用密切相关。

4参考文献

1Berger J，Hingais N.Intercapillary deposits of IgA-IgG〔J〕.J Urol Nephrol(Pans)，1968；74(9)：694-5.

2Radford MG Jr，Donadio JV Jr，Bergstralh EJ,etal.Predicting renal outcome in IgA nephropathy〔J〕.J Am Soc Nephrol，1997；8(2)：199-207.

3D′Amico G.Natural history of idiopathic IgA nephropathy and factors predictive of disease outeome〔J〕.Semin Nephrol，2004；24(3)：179-96.

4陆慧瑜，张巧玲，蒋小云，等.IgAN大鼠模型的建立〔J〕.中国误诊学杂志，2011；11(6)：1264-7.

5刘彦仿.免疫组织化学法〔M〕.北京：人民卫生出版社，1990：56-62.

6Kang H，Ahn KS，Cho C，etal.Immunomodulatory effect of Astragali Radix extract on murine Th1/Th2 cell lineage development〔J〕.Biol Pharm Bull，2004;27(12)：1946-50.

7Chen L，Martinez O，Ovebergh L，etal.Early up-regulation of Th2 cytokines and late surge of Th1 cytokines in an aopic dermatitis model〔J〕.Clin Exp Immunol，2004;138(3)：375-87.

8Nogaki F，Muso E，Kobayashi I，etal.Interleukin 12 induces crescentic glomerular lessions in a high IgA strain of ddY mice，independently of chang in IgA deposition〔J〕.Nephron Dial Transplant，2000;15(8)：1146-54.

9Chintalacharuvu SR，Yamashita M，Bagheri N，etal.T cell cytokine polarity as a determinant of immunoglobulin A(IgA)glycosylation and the severity of experimengtal IgA nephropathy〔J〕.Clin Exp Immunol，2008;153(3)：456-62.

10于大君，聂莉芳，许勇钢，等.益气滋肾颗粒对IgA肾病辅助性T淋巴细胞亚群的影响〔J〕.中国中西医结合，2006;26(9)：836-8.

〔2015-02-11修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者：张守琳(1969-)，女，博士，教授，主要从事中医肾脏病的研究。

基金项目：吉林省科技厅自然科学基金项目(No.2015101214JC)；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(吉教科合字2014第65号)；吉林省中医药管理局科技项目(No.2014-zd7)

〔中图分类号〕R28

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)04-0798-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.012