青藤碱注射液对兔膝骨关节炎关节液及血清细胞因子水平的影响

安永博　路　坦　宗海斌

(新乡医学院第一附属医院骨外二科，河南　新乡　453100)



青藤碱注射液对兔膝骨关节炎关节液及血清细胞因子水平的影响

安永博路坦宗海斌1

(新乡医学院第一附属医院骨外二科，河南新乡453100)

〔摘要〕目的观察青藤碱注射液对兔膝骨关节炎(OA)关节液及血清细胞因子水平的影响。方法日本大耳雄性白兔80只随机分为空白对照组，模型组，青藤碱组，阳性药(曲安奈德)组，每组20只。每周观察兔膝骨关节大体变化，并进行肉眼及镜下的兔膝关节评分，采用ELISA测定兔血清及关节液中细胞因子包括白介素(IL)-1β，IL-6，肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平。结果与空白对照组相比，模型组以及阳性药组、青藤碱组兔关节肿胀程度均显著增高(P<0.05)，在随后的治疗过程中，三组均始终高于空白对照组(P<0.05)，在治疗第1周，肉眼见模型组，阳性药组，青藤碱组兔膝关节均呈现高度肿胀，其围度测量数值无差异(P>0.05)，随着治疗的时间延长，阳性药组以及青藤碱组兔膝关节逐渐消肿，根据测量围度，在第2~5周其围度均小于模型组(P<0.05)，而阳性药组以及青藤碱组间差异不大(P>0.05)。随着治疗，阳性药组及青藤碱组每周围度均小于上周测量数值，至第4周阳性药组以及青藤碱组治疗进入平稳期，第5周与第4周两组兔膝关节围度测量结果相比无差异(P>0.05)。肉眼评分及镜下评分显示治疗第1周时，模型组、阳性药组以及青藤碱组与空白对照组相比评分显著增高(P<0.05)，三组间无差异(P>0.05)，随着治疗过程，模型组评分变化不大，阳性药组以及青藤碱组评分逐渐下降在治疗第2周时评分显著低于模型组(P<0.05)，两组间无差异(P>0.05)，之后青藤碱组与阳性药组与模型组评分差异逐渐增大，评分仍高于空白对照组(P<0.05)，两组间无差异(P>0.05)，至治疗第5周，阳性药组与青藤碱组与治疗第4周时组内评分变化无差异(P>0.05)。血清及兔膝骨关节液细胞因子检测结果显示，模型组，青藤碱组以及阳性药组治疗前后IL-1β，IL-6，TNF-α的表达水平始终高于空白对照组(P<0.05)，但青藤碱组以及阳性药组高出程度不及模型组，青藤碱组以及阳性药组IL-1β，IL-6，TNF-α的表达低于模型组(P<0.05)，而阳性药以及青藤碱组间无差异(P>0.05)。结论青藤碱可通过降低兔血清及膝关节液中炎症细胞因子的水平达到治疗膝OA的作用。

〔关键词〕青藤碱注射液；曲安奈德；膝关节炎；细胞因子

1新乡医学院基础医学院机能实验室

第一作者：安永博(1987-)，男，硕士，住院医师，主要从事骨外科研究。

膝骨关节炎(OA)临床上治疗多以缓解疼痛，改善患者关节功能和生活质量为主〔1，2〕，但是口服抗炎药物往往对患者自身造成其他不良影响，如损坏胃黏膜，对肝肾功能的不良影响等〔3〕。关节腔内局部注射药物是一种不仅起效较快且副作用相对较少的治疗方式〔4〕，青藤碱注射液是从中药青风藤中提取的生物碱单体盐酸盐，其化学结构类似于吗啡，具有抗炎，抑制免疫，镇痛等作用〔5〕。本研究观察青藤碱注射液对兔膝关节OA的临床疗效及对血清及关节液中细胞因子表达的影响。

1材料及方法

1.1动物、药品、试剂及仪器选择健康4~6月龄日本大耳雄性白兔80只，体重2.4~2.6 kg，由新乡医学院实验动物研究中心提供，许可证编号：SCXK(豫)2010-0001，在三级动物室无菌饲料喂养。高速冷冻离心机(德国贺利氏)、超低温冰箱、高倍数电子显微镜、图像分析系统等设备。青藤碱注射液(湖南正清制药集团股份有限公司生产，批号：050912032)；醋酸曲安奈德注射液(昆明积大制药股份有限公司生产，国药准字：H53021064)；木瓜蛋白酶溶液〔木瓜蛋白酶为Sigma公司产品(进口分装)，购自湖南丽欣生物有限公司，批号：P3250〕。兔白介素(IL)-1、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的ELISA 酶联免疫检测试剂(批号：0510094，上海西唐生物科技有限公司提供)。

1.2方法

1.2.1模型的分组、复制与给药实验动物自由饮食，无不良因素影响，饲养2 d以适应环境，参照文献选择木瓜蛋白酶关节腔内注射制造模型〔6〕，造模前精确测量所有动物右后膝关节直径、该关节最大活动度。除留作空白对照组的20只动物外，其余60只动物分别在每周的第 1、4、7 天时于右后膝关节腔内注射 4%的木瓜蛋白酶溶液0.3 ml进行造模。连续注射造模4 w后，再次测量造模关节的直径及活动度。将造模成功后的60只兔子随机分成三组，模型组，阳性药组以及青藤碱组，每组20只。所有动物均关节腔内注射给药，按Meeh-Rubner公式计算体表面积〔6〕每只兔子用量约为0.2 ml，所有动物在造模成功后第3天开始局部注射用药，每7天于各组兔子右后膝关节内局部注射药物，青藤碱组注射0.2 ml青藤碱注射液，阳性药组注射0.2 ml醋酸曲安奈德注射液，模型组注射0.2 ml无菌生理盐水，连续用药5 w，空白对照组兔子不做任何处理。

1.2.2观察指标及方法

1.2.2.1膝关节评分开始治疗后，每周随机选择每组4只兔子首先测量关节围度，继而采用耳缘空气静脉栓塞处死法处死，完整取兔子实验关节囊，观察兔子关节软骨变化。采用肉眼评分法以及镜下观察评分法，对每周每组兔子进行评分。

1.2.2.2关节液细胞因子检测按毕氏等介绍的关节冲洗液抽取方法，于造模前以及实验后，向兔子的左后膝关节腔内注入0.9%无菌氯化钠注射液0.5 ml，人工手动充分活动兔子的膝关节使其在关节腔内与关节滑液充分混合，再抽取关节腔洗液0.5 ml，2 000 r/min离心10 min后，取上清液于-20℃中保存检验IL-1、IL-6及TNF-α。

1.2.2.3血清细胞因子检测采用耳缘静脉取血法于造模前以及实验后，取各组兔子耳缘静脉血2 ml，离心后分离血清，于-20℃中保存待检验。

1.2.2.4兔膝关节的大体观察每周固定间隔时间，大体观察每组兔子的膝关节变化并测量关节围度。兔膝关节软骨的肉眼观察评分及镜下评分参考文献〔7〕。

1.3统计学方法采用SPSS17.0软件进行t检验及单因素方差分析。

2结果

2.1兔膝关节的大体观察与空白对照组相比，模型组以及阳性药组、青藤碱组兔关节肿胀程度均显著高于空白对照组(P<0.05)，在随后的治疗过程中，三组均始终大于空白对照组(P<0.05)，在治疗第1周，肉眼见模型组，阳性药组，青藤碱组兔膝关节均呈现高度肿胀，其围度测量数值无差异(P>0.05)，随着治疗的时间延长，阳性药组以及青藤碱组兔膝关节逐渐消肿，根据测量围度，在第2~5周其围度均小于模型组(P<0.05)，而阳性药组以及青藤碱组组间无差异(P>0.05)。随着治疗，阳性药组及青藤碱组每周围度均小于上周测量数值，至第4周阳性药组及青藤碱组治疗进入平稳期，第5周与第4周相比无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1　各时间点各组兔膝关节围度测量结果±s,cm,n=20)

与空白对照组比较：1)P<0.05，与模型组比较：2)P<0.05

2.2兔膝关节肉眼评分治疗第1周时，模型组、阳性药组以及青藤碱组与空白对照组相比评分显著增高(P<0.05)，三组间无显著差异(P>0.05)，随着治疗时间延长，模型组评分变化不大，阳性药组以及青藤碱组评分逐渐下降在治疗第2周时评分显著低于模型组(P<0.05)，两组间无显著差异(P>0.05)，之后青藤碱组与阳性药组与模型组评分差异逐渐增大，评分仍高于空白对照组(P<0.05)，两组间无显著差异(P>0.05)，至治疗第5周，阳性药组与青藤碱组与治疗第4周时无显著变化(P>0.05)。见表2。

2.3兔膝关节软骨镜下评分比较治疗第1周时，模型组、阳性药组以及青藤碱组与空白对照组相比评分显著增高(P<0.05)，三组间无显著差异(P>0.05)，随着治疗时间延长，模型组评分变化不大，阳性药组以及青藤碱组评分逐渐下降在治疗第2周时评分显著低于模型组(P<0.05)，之后青藤碱组与阳性药组与模型组评分差异逐渐增大，仍高于空白对照组(P<0.05)，但两组间无显著差异(P>0.05)，至治疗第5周，阳性药组与青藤碱组与治疗第4周时组内评分变化差异不显著(P>0.05)。见表3。

2.4各组治疗前后兔膝关节液中IL-1β，IL-6，TNF-α水平模型组，青藤碱组以及阳性药组治疗前后IL-1β，IL-6，TNF-α水平始终高于空白对照组(P<0.05)，但青藤碱组以及阳性药组高出程度不及模型组，青藤碱组以及阳性药组IL-1β，IL-6，TNF-α的水平低于模型组(P<0.05)，而阳性药组及青藤碱组无显著差异(P>0.05)。见表4。

表2　各组兔膝关节肉眼评分比较±s，分,n=4)

与空白对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与本组前一时间点比较：3)P<0.05，下表同

表3　各组兔膝关节软骨镜下评分比较±s，分,n=4)

表4　各组治疗前后兔膝关节液中IL-1β，IL-6，TNF-α的水平比较

2.5各组治疗前后兔血清IL-1β，IL-6，TNF-α水平模型组，青藤碱组以及阳性药组治疗前后IL-1β，IL-6，TNF-α的表达水平始终高于空白对照组(P<0.05)，但青藤碱组以及阳性药组高出程度不及模型组，青藤碱组与阳性药组IL-1β，IL-6，TNF-α的水平低于模型组(P<0.05)，而阳性药组与青藤碱组无显著差异(P>0.05)。见表5。

表5　各组治疗前后兔血清IL-1β，IL-6，TNF-α水平比较

3讨论

膝OA严重影响关节功能，患者常感到剧痛，影响行动，因此严重影响生活质量〔8〕。流行病学研究显示，影像学诊断支持的女性膝OA患病率明显高于男性，虽然随着年龄增长,男女各自的患病率呈升高趋势，但是女性发病人群仍然要高于男性〔9〕。目前认为本病的发病机制与关节软骨上压力形式及强度有关，随着患者年龄的增加，创伤，冲击力，关节负荷过度，劳损以及衰老都可加速关节软骨损伤，从而导致关节软骨的组成，结构及性质发生改变。而关节软骨是作为承载两活动骨之间的物质，主要成分为水以及胶原纤维，具有延伸特性，随着年龄的变化，其组织表面随张力将城乡不均匀分布并逐渐发生变化〔10〕。还有研究认为糖基化终末产物积聚可增加膝关节软骨的脆性，同时增加了膝关节组织老化，断裂的风险，随着年龄增长，其发生生物力学功能障碍的可能性也在逐渐增加，会导致膝关节软骨受损〔11〕。在正常的人体生理条件下，由细胞外基质的产生的各种成分组成一个稳定生理环境〔12〕，维持软骨细胞缓慢的新陈代谢，使其保持平衡，当软骨遭受生理，物理刺激下，状态会失衡，导致发生一些变化，如炎症发生，释放的细胞因子会导致软骨内环境改变，促进软骨成分变化，降解的发生。当膝OA发生时，IL-1β，IL-6，TNF-α表达升高。有研究表明炎症因子是软骨降解强有力的激活物，可促进软骨破坏及降解〔13〕。且在软骨的合成过程中，白介素家族如IL-1β，IL-6充当退化性细胞因子的角色，阻止软骨的合成，而TNF-α是致炎因子，导致软骨在高炎症应激环境下，因此可阻止软骨维持正常的合成代谢状态〔14〕。

膝OA在中医范畴内又名痹症〔15〕，中医认为本病的基本病机为风邪侵犯，瘀血阻络，病理基础为风、湿、寒、瘀等，历代医家以祛风除湿，活血化瘀立法〔16〕。膝OA的病变部位在关节处，在治疗痹症的众多药物中，藤类药〔17〕因能通经络，止弊痛，具有搜风通络直达患处之功效，故常被众多医家选用。青藤碱注射液是正清风痛宁的主要有效成分，具有祛风除湿、活血通络，消肿止痛作用，临床可用于风寒湿痹证，症见肌肉酸痛、关节肿胀，疼痛，屈伸不利，麻木僵硬及风湿与类风湿性关节具有上述证候者。现代药理学研究〔18〕表明青藤碱具有镇痛，抗炎，免疫调节等作用，可针对OA的发病与炎性反应，机械负荷紊乱，关节软骨营过度破坏，氧自由基干扰，自身免疫反应，软骨和滑膜中炎症因子增高等具有治疗作用，膝OA在临床上表现为膝关节疼痛，僵硬，活动受限甚至关节畸形，青藤碱的药理作用与膝OA的发病机制相符合，具有治疗膝OA临床依据。

关节腔内注射已成为针对风湿骨病患者常用的治疗手段〔19〕，局部作用具有见效快，副作用小等特点，曲安奈德注射液常作为局部注射治疗膝骨关节炎的一种，其疗效在临床上得到肯定，但由于激素类药物具有一定局限性〔20〕，针对其副作用等，每年应用次数有限。

本研究首先成功复制了膝OA模型，动物局部表现为膝关节肿胀，活动受限，其次在模型制作过程中，随着时间延长至第4~5周，膝关节肿胀变化逐渐平稳，提示模型在这个时间段已经是模拟膝OA较为合适的时机。随着治疗时间的延长各治疗组动物膝OA症状得到改善，血清及关节液中炎症细胞因子均明显下降，而阳性药组与青藤碱组间无显著差异，提示青藤碱组与阳性药组疗效相当。

综上所述，青藤碱可对兔膝OA具有治疗作用，5 w为1个疗程，是否还具有其他相关治疗机制将是今后研究的方向。

4参考文献

1申延清,刘风霞,曹红，等.膝骨关节炎患者的临床表现及相关影响因素〔J〕.中国组织工程研究与临床康复,2011;15(9)：1643-6.

2兰天露.膝骨关节炎患者关节腔注射玻璃酸钠后血清及关节液中可溶性Fas蛋白的变化〔J〕.中国组织工程研究,2012;16(3)：560-2.

3王君,何炳书,李笑萍，等.兔膝骨关节炎负重模型的建立〔J〕.中国老年学杂志,2005;25(9)：1079-80.

4熊元,赵振国,李传郡，等.兔膝骨关节炎模型的制备及鉴定〔J〕.实验动物科学,2013;30(3)：31-4,后插3.

5杨惠琴,陈礼荣.青藤碱对膝骨性关节炎兔关节液及血清白细胞介素1β含量的影响〔J〕.中西医结合学报,2008;6(12)：1275-9.

6李晓娟,王培训,刘良,等.青藤碱抗炎抗风湿作用机理研究〔J〕.广州中医药大学学报,2004;21(1)：34-6.

7王勇,钟兵,方勇飞,等.青藤碱对类风湿关节炎患者炎性细胞因子及抗环瓜氨酸肽抗体的影响〔J〕.第三军医大学学报,2005;27(15)：1573-5.

8丁从珠,姚瑶,方芸,等.青藤碱对胶原诱导的关节炎大鼠血清OPG/RANKL、IL-17含量的影响〔J〕.南京中医药大学学报,2012;28(4)：330-3.

9黄小鲁,郝飞,王勇,等.青藤碱对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞NF-κB的抑制作用〔J〕.第三军医大学学报,2007;29(13)：1269-72.

10牟慧,蔡辉,姚茹冰,等.青藤碱对佐剂性关节炎大鼠行为学特征和滑膜中TNF-α的影响〔J〕.山东医药,2013;53(9)：4-6,22.

11王勇,方勇飞,周新,等.青藤碱对佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞表达细胞因子的影响〔J〕.中华风湿病学杂志,2003;7(7)：415-9.

12王昊,刘天盛,陈旭义,等.青藤碱对胶原诱导性关节炎大鼠治疗作用〔J〕.中华实用诊断与治疗杂志,2015;29(6)：535-7.

13陈光星,王培训,刘清平,等.青藤碱对胶原诱导型关节炎免疫抑制作用的机制研究〔J〕.现代免疫学,2008;28(2)：142-6.

14方勇飞,王勇,周新,等.青藤碱对佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞核因子κB信号转导的影响及其机制〔J〕.中国临床康复,2005;9(7)：204-5.

15李景怡,吴玉章,陈永文,等.盐酸青藤碱抑制小鼠胶原性关节炎的实验研究〔J〕.免疫学杂志,2005;21(4)：313-6.

16杨德森,刘芳,曾繁典,等.青藤碱对大鼠佐剂性关节炎治疗作用及机制的研究〔J〕.中国中药杂志,2005;30(17)：1361-3.

17杨德森,刘芳,曾繁典,等.青藤碱对佐剂性关节炎大鼠血清及关节液细胞因子的影响〔J〕.中国现代应用药学,2006;23(4)：274-7.

18吴红娟,孙必强,朱传湘,等.盐酸青藤碱对家兔骨关节炎关节液IL-1β、PGE2生成与关节组织结构的影响〔J〕.湖南中医药大学学报,2010;30(9)：84-6.

19杨惠琴.青藤碱关节腔注射对骨关节炎兔细胞因子及软骨结构的影响〔D〕.武汉：湖北中医学院,2007.

20刘良,李晓娟,王培训,等.青藤碱对人外周血单个核细胞IL-1β和IL-8细胞因子基因表达的影响〔J〕.中国免疫学杂志,2002;18(4)：241-4.

〔2014-10-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

s

Effects of Sinomenine injection on knee osteoarthritis fluid and serum cytokines of rabbit

AN Yong-Bo,LU Tan,ZONG Hai-Bin.

Department of No.2 Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College,Xinxiang 453100，Henan，China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of Sinomenine injection treatment on knee osteoarthritis fluid and serum cytokines of rabbit.MethodsMale Japanese big ear rabbits were randomly divided into blank control,model,Sinomenine,positive drugs(triamcinolone acetonide)groups,20 in each group.Rabbit knee joint was observed weekly,naked eye and microscopic rabbit knee score were made.IL-1β,IL-6,TNF-α in serum and knee osteoarthritis fluid were measured by ELISA.ResultsCompared with the blank control group,joint swelling of rabbits were significantly higher in model,positive and Sinomenine groups(P<0.05),in the subsequent course of treatment,joint swelling of rabbits in the three groups were always greater than those of blank control group(P<0.05).In the first week of treatment,rabbit knee showed a high degree of swelling visually in the model,positive drug and Sinomenine groups,there were no significant differences among the three groups(P>0.05).With treatment prolonged,rabbit knee joint swelling in positive drug and Sinomenine groups gradually decreased.According to the measured circumference,rabbit knee joint circumference of positive drug and Sinomenine groups were less than those of model group in the first 2~5 weeks,the differences were significant(P<0.05),while there was no significant difference between positive drug and Sinomenine groups(P>0.05).With treatment prolonged,degrees around each measured value were less than those of last week in positive drug and Sinomenine groups.To the first four weeks,positive drug and Sinomenine groups entered a stable period,there was no significant difference in rabbit knee girth measurement between the fourth and the fifth week in positive drug and Sinomenine groups(P>0.05).At the first week,macroscopic and microscopic scores of model,positive drug and Sinomenine groups were significantly increased compared with those of control group(P<0.05),but there was no significant differences among the three groups(P>0.05).With the treatment process,score of the model group changed little,the score of positive drug and Sinomenine groups decreased,there were significant differences between treatment groups and model group from the second week(P<0.05),but the score was still higher than that of blank control group(P<0.05),and there was no significant difference between positive drug and Sinomenine groups(P>0.05).Compared with blank control group,levels of IL-1β，IL-6，TNF-α of serum and rabbit knee osteoarthritis fluid in model,positive drug and Sinomenine groups were obviously higher(P<0.05).Compared with model group,levels of IL-1β，IL-6，TNF-α of serum and rabbit knee osteoarthritis fluid in positive drug and Sinomenine groups were lower(P<0.05).There were no significant differences in levels of IL-1β，IL-6，TNF-α of serum and rabbit knee osteoarthritis fluid between positive drug and Sinomenine groups(P>0.05).ConclusionsSinomenine has therapeutic effect on knee osteoarthritis by decreasing serum and rabbit knee osteoarthritis fluid cytokines,five weeks is one course.

【Key words】Sinomenine;Triamcinolone acetonide;Knee osteoarrthritis;Cytokines

基金项目：河南省卫生厅医学科技攻关计划项目(No.201304029)

〔中图分类号〕R69

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)04-0788-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.008