野木瓜多糖对肝损伤大鼠的保护作用

陈雪梅

(遵义医学院附属医院儿科，贵州　遵义　563003)



野木瓜多糖对肝损伤大鼠的保护作用

陈雪梅

(遵义医学院附属医院儿科，贵州遵义563003)

〔摘要〕目的研究木瓜多糖对实验性肝损伤大鼠的保护作用及机制。方法采用四氯化碳诱导大鼠肝损伤,全自动生化分析仪分别检测血清总蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(GPT)及谷草转氨酶(GOT)；采用硫代巴比妥酸和黄嘌呤氧化法检测血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，应用Real-time PCR检测各组肝脏组织中转化生长因子(TGF)-β1的表达。结果木瓜多糖组血清TP、ALB较模型组显著增高，GPT、GOT活性显著降低；血清中SOD的活性均明显增高、MDA含量也显著降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性；与模型组相比，木瓜多糖组能够使大鼠肝脏内的TGF-β1 mRNA表达下降(P<0.05)。结论木瓜多糖的抗氧化作用及降低TGF-β1的表达可能是其对实验性肝损伤的保护机制之一。

〔关键词〕野木瓜多糖；肝损伤；超氧化物歧化酶；丙二醛；转化生长因子-β1

第一作者：陈雪梅(1974-)，女，硕士，副主任医师，主要从事小儿内科临床研究。

野木瓜为蔷薇科木瓜属植物，具有抗炎、抗病菌、抗衰老、抗肿瘤等作用，野木瓜富含有机酸、氨基酸、蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等多种元素和营养物质外，还含有多糖、皂苷、黄酮、果胶等化合物，是一种食药两用的珍贵天然植物〔1~3〕。目前木瓜多糖对肝脏的保护作用研究较少，本实验观察木瓜多糖对大鼠肝损伤中血清酶、蛋白合成能力的影响,探讨木瓜多糖对肝损伤的保护作用及可能机制。

1材料和方法

1.1材料 野木瓜购于贵州省遵义市正安县；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，四氯化碳(CCl4)(国药集团分析纯，批号20120125)；联苯双酯(浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号120116)；其余试剂为国产分析纯。721紫外-可见分光光度计(上海光电研究所)；BUCHI旋转蒸发仪(瑞士)。

1.2野木瓜多糖的制备野木瓜构于遵义市药材公司，采用水提醇沉法提取：取500 g野木瓜粉碎成粗粉，加入5 000 ml蒸馏水后加热提取3 h，纱布过滤后合并滤液，10 000 r/min离心20 min，然后采用BUCHI旋转蒸发仪浓缩至250 ml浓缩液。加入终浓度为80%的乙醇沉淀，静置24 h后，离心取沉淀。再将沉淀用蒸馏水溶解，用Seveage试剂(氯仿∶正丁醇=5∶1)脱蛋白数次后，进行24 h透析，其中流水透析12 h，蒸馏水静置12 h，取透析液浓缩后，冷冻干燥得到野木瓜多糖〔4~7〕。

1.3大鼠肝损伤模型的制备选用清洁级SD雄性大鼠〔购自第三军医大学动物实验中心，动物编号：SCXK(渝)2011-0005〕，10~12周龄，体重为150~180 g，模型组按3 ml/kg(CCl4与橄榄油按2∶3比例混合，3 ml/kg)皮下注射40%CCl4，对照组按3 ml/kg皮下注射橄榄油，每周2次，首剂加倍，连续注射4 w〔8~11〕。

1.4实验分组实验分六组，每组10只雄性大鼠：①正常组；②模型组：SD大鼠以3 ml/kg皮下注射40%CCl4，连续注射4 w；③阳性对照组：以联苯双酯100 mg·kg-1·d-1灌胃，连续4 w；④木瓜多糖组：大鼠实验性肝损伤模型+不同剂量野木瓜多糖灌胃(低、中、高剂量组分别以浓度为40、80、160 mg/kg野木瓜)，每天一次共4 w〔7〕。

1.5血清总蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)的测定于腹腔动脉取血，离心分离血清，利用全自动生化分析仪进行测定。

1.6SOD和MDA表达的测定按照试剂盒说明书测定各组血清SOD和MDA的水平。

1.7Real-time PCR测定肝脏中TGF-β1 mRNA表达大鼠肝脏总RNA采用Trizol法提取，然后采用实时定量-逆转录聚合酶链反应进行基因片段扩增并定量。大鼠TGF-β1及内参基因(β-actin)引物如下：TGF-β1上游引物为5'-atacgcctgagtggctgtct-3'，下游引物为5'- ttgggactgatcccattgat-3'；β-actin上游引物为5'-gtagccatccaggctgtgtt-3'，下游引物为5'-accctcatagatgggcacag-3'。反应条件：①Real-time PCR：95℃，5 s，59℃，20 s，72℃，20 s，40个循环。②溶解曲线：95℃，5 s，65℃，5 s，60个循环。PCR反应各管所加模板RNA的量约为1 μg。最终通过Real-time PCR仪记录的Ct值而对起始模板相对定量。

1.8统计学方法应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，两两比较应用SNK-q检验。

2结果

2.1TP、ALB、GPT、GOT的测定木瓜多糖组大鼠血清TP和ALB明显高于模型组，GPT和GOT水平明显低于模型组(P<0.05)，并且呈剂量依赖性；野木瓜多糖高剂量组大鼠血清中TP，ALB，GPT和GOT水平与阳性对照组无明显差异(P>0.05)。见表1。

表1　野木瓜对大鼠血清TP、ALB、GPT、

与模型组比较：1)P<0.05，下表同

2.2SOD和MDA表达的测定木瓜多糖组大鼠血清中SOD明显高于模型组，MDA水平明显低于模型组(P<0.05)，并且呈剂量依赖性；木瓜多糖高剂量组大鼠血清中SOD和 MDA水平与阳性对照组无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2　野木瓜对大鼠血清中SOD和MDA

2.3Real-time PCR测定肝脏中TGF-β1 mRNA表达模型组TGF-β1 mRNA的表达高于正常组(206.47±9.14 vs 38.25±2.09，P<0.05)，木瓜多糖低、中、高剂量组中TGF-β1 mRNA明显低于模型组(136.85±8.31、97.96±4.61、58.42±4.87，P<0.05)。阳性对照组(54.31±3.28)与木瓜多糖高剂量组无显著差异(P>0.05)。

3讨论

肝脏是人体内最大的实质性腺体，是体内新陈代谢的中心站。肝损伤是肝脏最常见的病理过程，由此引起的肝脏疾病如肝纤维化、肝硬化及肝肿瘤等严重危害人类的健康，因此对肝脏损伤的药物研究具有重要意义。

木瓜为蔷薇科木瓜属，是一种营养丰富的药食两用的“果之珍品”，中医认为木瓜有舒筋活络、健脾开胃，舒肝止痛，祛风除湿之效；能治疗腰膝疼痛、脚气水肿、痢疾霍乱、心痛腹痛等疾病。另外，木瓜还有抗菌消炎、护肝降酶、清暑利尿、解酒祛痰等作用。对于木瓜化学成分的研究表明，其中含有苹果酸、枸橼酸、酒石酸、抗坏血酸等多种有机酸以及苷类、黄酮、氨基酸、鞣质等成分，但对木瓜多糖的研究则鲜见报道。

CCl4可使大鼠体内产生大量的自由基，而肝脏极易受到自由基的侵害而发病，造成肝损伤。CCl4肝损伤模型是经典的化学性肝损伤动物模型，CCl4模型中CCl4在肝微粒体细胞色素P-450激活下生成CCl3·自由基，这些自由基可与肝细胞内大分了发生其价结合，也可攻击膜不饱和脂质，引起脂质过氧化，使肝细胞损伤，转氨酶从受损的肝细胞内溢出，使血清中转氨酶升高。MDA是脂质过氧化的主要降解产物，可进一步损伤肝细胞的结构，导致肝细胞坏死，其含量的大小可以间接反映自由基对组织的破坏程度。MDA通常和SOD联合使用，一起反映氧自由基对细胞的损伤程度。本实验说明木瓜多糖能够改善CCl4引起的肝功能损伤。

TGF-β1是被公认为与肝纤维化发生关系最为密切的细胞因子，不仅促进成纤维细胞的增殖及分化，促进胶原蛋白等细胞外基质成分的基因转录及蛋白合成 通过抑制蛋白酶的合成来阻止基质蛋白的降解．而且可诱导巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞参与炎性反应〔12，13〕。本实验结果显示木瓜多糖能过明显降低模型组中TGF-β1 mRNA的表达。

综上，木瓜多糖能够改善CCl4所致的肝脏损伤，其机制可能与其增加自由基清除酶活力，清除辐射过程中脂质过氧化物的形成及降低TGF-β1 mRNA 的表达有关，为野木瓜的食用药用研究提供了新的实验依据。

4参考文献

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〔2014-08-30修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

〔中图分类号〕Q813.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)04-0775-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.003