阴离子化高分子包覆非病毒载体提高有血清环境下RNA干扰效率的研究

王 晶 谢丽菲 孟 洁 刘 健 许海燕

(中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院，北京 100005)

阴离子化高分子包覆非病毒载体提高有血清环境下RNA干扰效率的研究

王 晶 谢丽菲 孟 洁 刘 健#*许海燕#*

(中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院，北京 100005)

大多数阳离子化高分子载体在血清环境中会大量吸附血清蛋白而导致转染效率低下，因而难以应用于临床。设计合成羧基化葡聚糖(Dex-COOH)和羧基化葡聚糖修饰富勒烯(C60-Dex-COOH)两种阴离子化高分子，并将其包覆在精胺化普鲁兰(Ps)与siRNA形成的复合物(PS/siRNA)外层，以减少复合物对血清蛋白的吸附。采用DLS/ELS检测阴离子包覆前后复合物的颗粒粒径及Zeta电位；用QCM-D验证阴离子包覆层的形成，并评价包覆层对牛血清白蛋白(BSA)吸附的影响；同时应用cck-8试剂、流式细胞术，检测包覆前后及不同包覆比例下复合物的细胞毒性、进入细胞的情况及对Hela-EGFP细胞的干扰效率。结果表明，Dex-COOH与C60-Dex-COOH能够在PS/siRNA外部形成稳定的负电性包覆层，有效阻止BSA的吸附，并在无血清的条件下显著降低复合物的细胞毒性；在有血清的环境中，表面包覆了阴离子化高分子的复合物可以不受血清蛋白的影响而被细胞大量摄取。对包覆了C60-Dex-COOH的PS/siRNA复合物转染组施加光照，可促使复合物从溶酶体中逃逸，将血清条件下PS/siRNA的干扰效率提高20%。该策略可有效提高阳离子化高分子载体介导的RNA干扰效率。

阳离子化高分子；siRNA载体；阴离子包覆层；蛋白吸附；RNA干扰

引言

基因治疗(gene therapy)是一种全新的治疗手段，近年来受到广泛关注[1-3]。但是，核酸分子本身难以进入细胞，而且在体内环境中易被酶破坏[4]。因此，利用递送载体将核酸分子导入到目标细胞内部并使其发挥作用，是实现基因治疗的一个关键环节。在此背景下，各种类型的核酸载体被不断研发，其中非病毒载体由于具有免疫原性低、无载体容量限制、材料来源广泛、化学结构可控制且易于大量制备等诸多优点，始终是核酸载体领域的研究热点之一[5]。

目前的非病毒载体大多属于阳离子聚合物或阳离子脂质体，其主要特点是载体分子中含有大量在生理条件下带正电的基团，可以与带负电的核酸分子形成带正电的复合物，从而通过静电作用接近并进入细胞，并利用质子海绵效应促进溶酶体破裂和核酸分子的释放[6-7]。但是，阳离子载体在使用上仍存在一些缺陷[8-10]：一是过高的阳离子基团会造成细胞膜损伤，并导致严重的细胞毒性。二是在有血清培养的条件下，阳离子载体在短时间内会大量吸附血清蛋白，形成蛋白冠，导致复合物难以接近并进入细胞；即使进入了细胞，表面吸附的蛋白也会削弱其引起的质子海绵效应，降低溶酶体逃逸效率。三是在体内环境下，由于静电作用的非特异性，阳离子载体难以精确到达目标细胞。尽管有研究表明，通过表面修饰靶向性分子可以提高载体的特异性，但蛋白冠的形成仍会妨碍靶向分子的作用[11-12]。此外，吸附了血浆蛋白的复合物容易发生聚集，并在体内循环中被快速清除[13]。以上这些因素，极大限制了阳离子载体的应用。

在以往工作中，将天然大分子普鲁兰多糖经过侧链精胺修饰得到了普鲁兰精胺(pullulan-spermine，PS)，发现其具有良好的转染效率，是一种有前途的阳离子化非病毒载体[14]。本研究的目的是通过静电自组装作用，在PS与siRNA所形成的复合物(PS/siRNA)表面构筑一层负电性外壳，一方面降低载体的细胞毒性，另一方面阻止蛋白的吸附。考虑到被负电层包裹后复合物难以通过质子海绵效应实现溶酶体逃逸，进一步在阴离子高分子链中引入C60以赋予负电层光敏特性，利用光照触发细胞内活性氧(ROS)的产生，进而破坏溶酶体膜，帮助复合物从溶酶体中释放，提高RNA干扰效率。

1 方法

选用如下材料：普鲁兰多糖、精胺、氰基硼氢化钠、葡聚糖、羰基二咪唑(CDI)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，购自Sigma-Aldrich公司(美国密苏里州)；乙二胺、丁二酸酐、巯基丙酸、牛血清白蛋白(BSA)、邻二氯苯、二甲基亚砜(DMSO)，购自阿拉丁生化科技股份有限公司(中国上海)；EGFP siRNA(5′-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCA-3′)[15]、NC siRNA(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′)[16]及荧光标记的siRNA(siRNA-FAM)，购自吉玛制药技术有限公司(中国上海)；人宫颈癌细胞系Hela及绿色荧光蛋白标记人宫颈癌细胞Hela-EGFP，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，并在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素与100 U/mL链霉素的DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州)中进行培养。

1.1 羧基化葡聚糖(Dex-COOH)的制备

称取分子量10 000的葡聚糖100 mg，溶于30 mL无水DMSO中，分别加入丁二酸酐200 mg、DMAP 5 mg，在40℃下反应24 h。产物置于截留分子量为3 500的透析袋中(Viskase Companies Inc)，以纯净水透析2 d后冷冻干燥3 d(LGJ-10C型，军事医学科学院实验仪器厂, 中国北京)。

1.2 羧基化葡聚糖修饰富勒烯(C60-Dex-COOH)的制备

1.2.1 末端氨基化葡聚糖的制备

称取葡聚糖(分子量10 000)500 mg，以50 mL的PB缓冲液(pH=7.5)溶解，在室温搅拌下缓缓加入乙二胺溶液(5 mL，99%+)。加入浓盐酸调节pH至7.5后，向其中加入氰基硼氢化钠20 mg，在磁力搅拌及60℃水浴加热条件下反应18 h。将反应液置于截留分子量为3 500的透析袋中，以纯净水透析2 d后冷冻干燥3 d。

1.2.2 葡聚糖修饰C60(C60-Dex)的制备

称取0.72 mg的C60，溶于5 mL邻二氯苯中，使其充分溶解。称取100 mg末端氨基化葡聚糖，溶于15 mL DMSO中。在37℃水浴中搅拌20 min，使其充分溶解。将两相充分混合后，在15 W的LED灯光下室温搅拌反应24 h。向产物中加入100 mL双蒸水，充分混匀后分装于50 mL的离心管中，以3 500 r/min离心30 min。取上层含有水溶性富勒烯的水溶液，透析(截留分子量12 000～14 000)除去DMSO。将溶液分装于15 mL的离心超滤管(sartorius，截留分子量30 000)中，以4 500 r/min离心45 min。弃去下层滤液，并在上层加入双蒸水后再次离心洗涤，重复该操作3次。收集上层滤液，并进行冷冻干燥。

1.2.3 C60-Dex的羧基化

称取100 mg的C60-Dex，溶于30 mL无水DMSO中。分别加入200 mg丁二酸酐及5 mg DMAP，40℃下搅拌反应24 h。产物置于截留分子量为8 000的透析袋中，以纯净水透析2 d后冷冻干燥。

1.3 阴离子化高分子包覆PS/siRNA复合物的制备

利用静电自组装，按照以前报道的方法合成PS并纯化[17]。将20 μL的siRNA(0.5 μg/μL)缓慢滴加于50 μL的PS水溶液(2 mg/mL)中，充分震荡1 min后静置15 min，使PS与siRNA形成稳定的PS/siRNA复合物(N/P=20)。将70 μL含PS/siRNA复合物溶液分别滴加至70 μL不同浓度的Dex-COOH或C60-Dex-COOH水溶液中，充分震荡1 min后静置10 min，获得不同包覆比例(阴离子化高分子与PS/siRNA复合物中PS的摩尔比)的阴离子化高分子包覆PS/siRNA复合物(PS/siRNA@Dex-COOH与PS/siRNA@ C60-Dex-COOH)。

1.4 复合物粒径及表面电位的检测

取不同配比的PS/siRNA@Dex-COOH或PS/siRNA@C60-Dex-COOH，配制成0.1 mg/mL的水溶液。按照仪器说明，取1 mL待测溶液置于样品池中，在25℃条件下，检测复合物的粒径及Zeta电位(Zetasizer Nano ZS，马尔文公司，美国)。

1.5 阴离子化高分子包覆层的形成及蛋白吸附的检测

1.5.1 准备表面为PS层的QCM芯片

将石英晶体微天平(QCM)金芯片表面用Piranha溶液(浓H2SO4∶30%H2O2=3∶1)处理后用超纯水洗净，迅速置于0.1%的巯基丙酸(MPA)溶液中浸泡2 h，并再次用纯净水洗净，从而在金表面组装上一层巯基丙酸的单层膜。将200 μL EDC(10 mg/mL)和200 μL NHS(10 mg/mL)滴加至金芯片表面，室温活化30 min后用纯净水洗净，并滴加1 mg/mL的PS水溶液200 μL于芯片表面，继续在室温下孵育2 h。最后，用水纯净水将芯片洗净晾干备用。

1.5.2 BSA吸附量的测量

配制浓度为0.5 mg/mL的Dex-COOH水溶液，及0.01 mg/mL 的牛血清白蛋白(BSA)水溶液(PBS，pH=7.5)。将石英芯片置于QCM-D检测器(Q-Sense E4，瑞典Biolin公司)中，37℃下缓慢通入双蒸水。待基线稳定后，实验组通入Dex-COOH溶液，使PS表面吸附一层Dex-COOH。待吸附量达到饱和时，实验组与对照组同时通入BSA水溶液至吸附达到饱和，记录整个过程中QCM芯片振动频率的变化，从而计算芯片表面物质吸附量的变动情况。

1.6 流式细胞分析术检测细胞对复合物的摄取

将Hela细胞按照60 000个/孔的密度播种于12孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中过夜，使细胞贴壁。分别将PS/siRNA-FAM及不同包覆比例的PS/siRNA-FAM@Dex-COOH或PS/siRNA-FAM@C60-Dex-COOH加入孔内，使每孔中siRNA的量均为1 μg。37℃孵育4 h后，弃掉培养基，用PBS轻轻冲洗两遍，用0.125%胰酶消化后离心收集细胞，用流式细胞仪(C6, BD公司，美国)检测细胞中的FAM荧光强度。

1.7 PS/siRNA复合物处理后细胞活性的检测

将Hela细胞按照6 000个/孔的密度播种于96孔板中，置于37℃的二氧化碳培养箱中过夜，使细胞贴壁。分别将PS/siRNA及同包覆比例的PS/siRNA@Dex-COOH或PS/siRNA@C60-Dex -COOH 加入孔内，使每孔中siRNA(NC)的量均为0.1 μg。37℃孵育4 h后，弃掉培养基，用PBS轻轻冲洗两遍。向每孔中加入含10% cck-8(Cell Counting Kit-8，同仁化学公司，日本)的新鲜培养基100 μL，继续在37℃孵育2 h。用酶标仪(Synergy H1， Bio Tek公司,美国)，检测450 nm波长下的吸光度值。

1.8 流式细胞术检测复合物的干扰效率

将Hela-EGFP细胞按照60 000个/孔密度播种于12孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中过夜，使细胞贴壁。分别将PS/siRNA及不同包覆比例的PS/siRNA@Dex-COOH或PS/siRNA@C60-Dex-COOH加入孔内，使每孔中siRNA(EGFP)的量均为1 μg。37℃孵育4 h后，PS/siRNA-EGFP@ C60-Dex-COOH组光照10 min (15 W LED灯)。弃掉培养基，用PBS轻轻冲洗两遍，加入1 mL新鲜培养基，继续培养48 h。用0.125%胰酶消化后离心收集细胞，用流式细胞仪(C6, 美国BD公司检)测细胞的EGFP荧光强度。

1.9 统计分析

采用SPSS17.0软件，对实验数据进行t检验。P<0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阴离子包覆的PS/siRNA复合物的制备及表征

在研究中，合成了Dex-COOH(见图1(a)的上图)和C60-Dex-COOH(见图1(b)的上图)两种阴离子化多糖，通过静电自组装作用，在正电性的PS/siRNA(NC)复合物外部形成阴离子化高分子的包覆层。由DLS/ELS检测包覆前后复合物的颗粒尺寸及Zeta电位可知，包覆前PS/siRNA的尺寸为165 nm，Zeta电位为+43 mV，带有大量多余正电荷。经Dex-COOH和C60-Dex-COOH包覆后，Zeta电位均变为负值(-20 ～ -40 mV)，表明两种阴离子化高分子确实能够形成稳定的负电性包覆层，并能有效遮蔽PS/siRNA表面的正电荷。包裹后颗粒的尺寸较原始的PS/siRNA均略有减小，提示包覆后形成的负电层对带正电的复合物会产生一定的压紧效果。

图1 阴离子化高分子的分子结构(上)和不同包覆比下PS/siRNA复合物颗粒的尺寸与Zeta电位(下)。(a)Dex-COOH；(b)C60-Dex-COOH。 Fig.1 The chemical structure (above), hydrated diameter and Zeta potential (below) of PS/siRNA at different coating ratio.(a) Dex-COOH; (b) C60-Dex-COOH.

2.2 阴离子化高分子包覆对PS表面蛋白吸附的影响

为了进一步验证PS表面是否能形成阴离子包覆层，并研究阴离子包覆层的形成是否能够抑制PS/siRNA复合物对血清蛋白的吸附，首先在QCM金芯片表面共价包被了一层PS分子，以模拟PS/siRNA复合物的表面；阴离子化高分子及蛋白分子在PS表面的吸附情况可以通过QCM芯片的振动频率F值(吸附量)及耗散因子D值(吸附层的黏弹性属性)的变化进行表征[18-19]。

当BSA流过包被了PS的芯片表面时，F值迅速下降，说明带正电的PS能够在短时间内迅速吸附大量BSA；而此时D值并无明显变化，说明吸附的蛋白层结构紧密，呈刚性(见图2(a))。而向包被PS的芯片表面通入阴离子化高分子(Dex-COOH)溶液时，F值缓慢下降，D值略微上升后达到平衡，表明Dex-COOH可以在PS表面形成一层稳定的弹性吸附层；随后在更换BSA溶液流过时，F值仅有轻微的下降，并在接下来的400余秒(1 200～1 620 s)内基本保持不变，表明阴离子层的形成能够有效减少BSA的吸附。在持续通入BSA的条件下，1 620 s之后F值会再次出现缓慢下降，而D值略有上升，推测是由于Dex-COOH被逐渐洗脱而导致了蛋白的再次吸附，但此时形成的白蛋白分子的吸附层与对照组相比其结构比较松散，因此呈现一定的黏弹性(见图2(b))。

图2 向PS包被的QCM芯片表面通入Dex-COOH及BSA时芯片振动频率F及耗散因子D的变化。(a)单纯通入BSA(0.01 mg/mL)；(b)先后通入Dex-COOH(0.5 mg/mL)及 BSA(0.01 mg/mL)Fig.2 The changes of F and D curves after adsorption of different materials on the QCM chip coated with PS. (a) The adsorption of BSA (0.01 mg/mL); (b)The adsorption of Dex-COOH(0.5 mg/mL)and BSA (0.01 mg/mL)

2.3 阴离子化高分子的包覆量对细胞内吞的影响

图3 Hela细胞与不同包覆状态的复合物颗粒孵育后荧光阳性细胞的比率(上)及细胞的平均荧光强度(下)(*P<0.05,**P<0.01:与有血清条件下PS/siRNA组平均荧光强度相比具有显著性差异)。(a)不同包覆比例的PS/siRNA-FAM@Dex-COOH；(b)不同包覆比例的PS/siRNA-FAM@C60-Dex-COOHFig.3 The percentage of positive cells (above) and mean fluorescence intensity (below) of Hela cells cultured in the presence of different complexes with different coating ratio (*P<0.05,**P<0.01: significance against mean fluorescence intensity of PS/siRNA with serum). (a) PS/siRNA-FAM@Dex-COOH; (b) PS/siRNA@C60-Dex-COOH

将Hela细胞与荧光标记的PS/siRNA-FAM共孵育后，通过流式细胞术对细胞的荧光强度进行分析，以评价血清和包覆比例(阴离子化高分子与PS/siRNA复合物中PS的摩尔比)对PS/siRNA内吞量的影响(见图3)。由实验结果可知，无论是否存在血清，不同包覆比例的PS/siRNA复合物均能进入细胞，且阳性率均能达到80%以上。平均荧光强度的数据表明，PS/siRNA复合物进入细胞的量受血清及包被条件的影响很大。在无包覆时，无血清条件下平均荧光强度是有血清条件下的4倍，推测可能是复合物表面吸附大量蛋白后产生的电位反转影响了细胞的内吞；而预先经阴离子化高分子包覆的PS/siRNA进入细胞的数量则不受血清条件的影响，但与包覆分子种类及包覆比密切相关。对于PS/siRNA@Dex-COOH而言，当包覆比为3∶1时，细胞的平均荧光强度达到最高，较未包覆时明显升高，甚至略高于无血清、无包覆条件下细胞的荧光强度；但当包覆比例继续增大时，平均荧光强度反而逐渐减少。当使用C60-Dex-COOH作为包覆分子时，不同包覆比下细胞的平均荧光强度差别较小，均较未包覆时有明显提高，并且在包覆比为3.5时达到最大值，但都低于无血清、无包覆条件下细胞的平均荧光强度。

2.4 阴离子化高分子的包覆量对PS/siRNA复合物细胞毒性的影响

图4为包覆前后PS/siRNA复合物对细胞毒性的影响。由图可知，PS/NC siRNA在无血清条件下表现出了较强的细胞毒性，经过4 h的转染后，Hela细胞的活性仅有对照组的20%；而在有血清培养条件下，细胞活性接近对照组的80%，表明血清中蛋白的吸附虽然影响了PS的内吞，但能够大幅降低PS的细胞毒性。在表面包覆Dex-COOH与C60-Dex-COOH两种阴离子化高分子后，无血清条件下转染后细胞的活性有明显升高，并且在各种包覆比下均能够达到60%以上，表明阴离子化高分子的包覆能够有效遮蔽PS/NC siRNA表面的正电荷，降低无血清环境下复合物的细胞毒性；而在有血清环境下，高分子的包覆对细胞活性没有显著影响。

图4 经PS/siRNA及不同包覆状态复合物处理后Hela细胞的相对细胞活性(siRNA(NC)的量为0.1 μg/孔，正常培养组细胞的活性设为1(con.组中的白色柱;*P<0.05，**P<0.01)：与无血清条件下PS/siRNA组细胞活性相比，具有显著性差异)。(a)不同包覆比例的PS/siRNA@Dex-COOH；(b)不同包覆比例的PS/siRNA@C60-Dex-COOH。Fig.4 The cell viability ratio of Hela cells cultured in the presence of different complexes with different coating ratio (The amount of siRNA (NC) added to each well was 0.1 μg; The cell viability of untreated group (with serum) was set to 1 and white column is the control group;*P<0.05,**P<0.01: significance against cell viability of PS/siRNA without serum). (a) PS/siRNA-FAM@Dex-COOH; (b) PS/siRNA@C60-Dex-COOH

2.5 流式细胞术检测复合物干扰效率

将PS/siRNA及不同包覆比例的PS/siRNA @Dex-COOH、PS/siRNA@C60-Dex-COOH与Hela-EGFP细胞共孵育4 h后，对PS/siRNA@ C60-Dex-COOH组给予10 min光照，继续孵育48 h后，通过流式细胞术检测细胞的平均荧光强度，评价RNA干扰效率(见图5)。由实验结果可知，无血清条件下，未包覆的PS/siRNA-EGFP干扰效率最高，能够达到60%以上。阴离子化高分子包覆后的PS/siRNA-EGFP所介导的干扰效率明显降低，特别是Dex-COOH包覆组的干扰效率均在20%以下；而C60-Dex-COOH包覆对干扰效率的影响相对较小，经过光照射后可以达到40%左右(包覆比高于3.5时)。但是，在有血清的环境下，未包覆的PS/siRNA-EGFP介导的干扰效率则显著降低，只能达到约15%；用Dex-COOH包覆后，干扰效率没有明显提高；但是对C60-Dex-COOH 包覆的PS/siRNA-EGFP复合物进行可见光照射后，包覆比例高于3.5的复合物所介导的干扰效率显著提高，达到40%，相比有血清条件下的PS/siRNA-EGFP，其干扰效率提高了约20%。

图5 利用流式细胞术检测不同包覆状态的PS/siRNA复合物对Hela-EGFP细胞的干扰效率。 (a) 不同包覆比例的PS/siRNA@Dex-COOH;(b)不同包覆比例的PS/siRNA@C60-Dex-COOH, siRNA(EGFP)的量为1 μg/孔 (**P<0.01：与有血清条件下PS/siRNA组干扰效率相比具有显著性差异)Fig.5 The RNA interference efficiency of Hela-EGFP cells culture in the presence of PS/siRNA@Dex-COOH (a) or PS/siRNA@C60-Dex-COOH (b) With different coating ratio, the amount of siRNA (EGFP) added to each well was 1 μg (**P<0.01: significance against RNA interference efficiency of PS/siRNA with serum)

3 讨论

基于siRNA、mRNA等的RNA干扰治疗可以特异性地沉默细胞内特定基因的表达，与质粒等核酸药物不同，RNA药物只要进入细胞质即可发挥作用，而且不会改变目标细胞的基因序列，具有特异性好的优势且安全性较高，因此成为基因治疗中的一个重要技术。但是，缺乏合适的载体是妨碍RNA干扰治疗进入临床的一个主要瓶颈。阳离子非病毒载体在无血清条件下易于获得较高的干扰效率，但同时也伴随着较高的细胞毒性；在有血清条件下，血清蛋白的吸附会显著降低阳离子载体的细胞毒性，但同时也会妨碍细胞对载体的内吞，并使其难以发挥质子海绵效应，从而导致干扰效率的低下。因此，这一悖论是目前阳离子载体所不能回避的一个共同问题。降低无血清条件下的细胞毒性，或提高有血清条件下的转染效率，也正是目前非病毒载体研究中的一个主要目标。本研究设计了siRNA载体，其特点是利用光敏性阴离子化高分子的静电自组装，在siRNA载体外层形成带负电的高分子层，在无血清条件下抑制细胞毒性，在有血清条件下阻碍血清蛋白的吸附，并利用光敏剂的光化学内化(photochemical internalization，PCI)效果提高核酸药物的溶酶体逃逸效率，从而有望获得良好的基因干扰效果。

在前期工作中，制备了一种精胺修饰的普鲁兰多糖(PS)，发现它对很多细胞都能发挥良好的转染效率，但在含血清培养条件下其转染效率会受到蛋白吸附的影响[20]。基于此，本研究以PS作为模式阳离子非病毒载体，将合成的两种阴离子化大分子Dex-COOH和C60-Dex-COOH通过静电作用吸附于PS/siRNA表面，形成稳定的包覆层，使复合物表面带负电荷，在一定时间内有效阻止BSA的吸附。

综合分析比较细胞内吞、毒性及转染效率的结果可以看出：在无血清的条件下，阴离子化高分子包覆层对正电荷的遮蔽作用能够有效降低复合物的细胞毒性；同时，通过优化包覆比，仍然能够获得接近于非包覆组无血清条件下的内吞量。虽然包覆后干扰效率有所降低，但当包覆材料为C60-Dex-COOH时，由于C60的光敏性而使干扰效率达到40%以上，与未包覆组相比，仅仅降低了大约20%，但转染后的细胞活性却大幅提高了3倍左右，这一低毒特性对原代细胞、干细胞等敏感细胞的转染会有很大的帮助。

在有血清的环境中，细胞毒性不再是阳离子siRNA载体的主要障碍，如何提高RNA干扰效率成为其首要目标。相比未包覆组，阴离子化高分子包覆层促进了细胞对复合物的摄取，复合物的内吞量可接近于无血清条件下的非包覆组。这可能是PS/siRNA被阴离子化多糖包覆后，细胞表面的糖蛋白受体也可能有助于其被细胞内吞，而不仅仅依赖于静电吸附作用。但是，更多进入了细胞的PS/siRNA@ Dex-COOH并不能明显提升PS/siRNA的干扰效率，推测是包覆阴离子化高分子层的PS/siRNA复合物被限制在溶酶体中，由于表面缺少阳离子而难以发挥质子海绵效应，不能及时从溶酶体中逃逸。当采用光敏性阴离子化高分子C60-Dex-COOH作为包覆层时，光照刺激能够有效提高PS/siRNA@C60-Dex-COOH的干扰效率，提示光照下C60诱发了活性氧的产生，能够有效破坏溶酶体膜，促进siRNA进入细胞质，从而有效地发挥RNA干扰作用。

4 结论

Dex-COOH与C60-Dex-COOH两种阴离子化高分子均能够在PS/siRNA复合物外部形成稳定的负电性包覆层，可有效阻止血清白蛋白的吸附；在无血清的条件下，显著降低复合物的细胞毒性；在有血清的环境中，阴离子化高分子包覆可以在不增加细胞毒性的情况下，显著提高复合物的内吞量；而光敏性C60-Dex-COOH的包覆能够在光照条件下帮助复合物从溶酶体中逃逸，从而有效提高有血清条件下PS/siRNA的干扰效率。

[1] Maguire AM, High KA, Auricchio A, et al. Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial [J]. Lancet,2009, 374(9701):1597-1605.

[2] Cartier N, Hacein-Bey-Abina S, Bartholomae CC, et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy [J]. Science, 2009, 326 (5954):818-823.

[3] Dong Jie, Li Song, Mo Jinglin, et al. Nurr1-based therapies for Parkinson′s disease [J]. CNS Neurosci Ther, 2016, 22(5):351-359.

[4] Fan Xiaohui, Zhao Yanli, Xu Wei, et al. Linear-dendritic block copolymer for drug and gene delivery [J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2016, 62:943-959.

[5] Collins M, Thrasher A. Gene therapy:progress and predictions [J]. Proc Biol Sci, 2015, 282(1821): 2014-3003.

[6] Pack DW, Putnam D, LangerR. Design of imidazole-containing endosomolytic biopolymers for gene delivery [J]. Biotechnol Bioeng, 2000, 67(2):217-223.

[7] Moreira C, Oliveira H, Pires LR, et al. Improving chitosan-mediated gene transfer by the introduction of intracellular buffering moieties into the chitosan backbone [J]. Acta Biomater, 2009, 5:2995-3006.

[8] Hunter AC. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2006, 58:1523-1531.

[9] Zhang Jingshi, Liu Feng, Huang L. Implications of pharmacokinetic behavior of lipoplex for its inflammatory toxicity [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2005, 57:689-698.

[10] Reischl D, Zimmer A. Drug delivery of siRNA therapeutics: potentials and limits of nanosystems [J]. Nanomedicine, 2009, 5:8-20.

[11] Ogris M, Brunner S, Schüller S, et al. PEGylated DNA/transferrin-PEI complexes: reduced interaction with blood components, extended circulation in blood and potential for systemic gene delivery [J]. Gene Ther, 1999, 6:595-605.

[12] Rekha MR, Sharma CP. Blood compatibility and in vitro transfection studies on cationically modified pullulan for liver cell targeted gene delivery [J]. Biomaterials, 2009, 30:6655-6664.

[13] Sun Jingjing, Luo Ting, Sheng Ruilong, et al. Preparation of functional water-soluble low-cytotoxic poly (methacrylate)s with pendant cationic L-lysines for efficient gene delivery [J]. Macromol Biosci, 2013, 13(1):35-47.

[14] Liu Jian, Tabata Y. Effect of modification manner on the photodynamic antitumor activity of C60 modified with pullulan [J]. J Biomater Sci Polym Ed, 2011, 22(16):2147-2163.

[15] Tiscornia G, Singer O, Ikawa M, et al. A general method for gene knockdown in mice by using lentiviral vectors expressing small interfering RNA [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100:1844-1848.

[16] Villares GJ, Zigler M, Wang Hua, et al. Targeting melanoma growth and metastasis with systemic delivery of liposome-incorporated protease-activated receptor-1 small interfering RNA [J]. Cancer Res, 2008, 68:9078-9086.

[17] Ma Wenjuan, Liu Jian, XieJundan, et al. Modulating the growth and imatinib sensitivity of chronic myeloid leukemia stem/progenitor cells with pullulan/microRNA nanoparticles in vitro [J]. J Biomed Nanotechnol,2015, 11(11):1961-1974.

[18] Glomm WR, Halskau Ø Jr, Hanneseth AM, et al. Adsorption behavior of acidic and basic proteins onto citrate-coated Au surfaces correlated to their native fold, stability, and PI [J]. J PhysChem B, 2007, 111(51):14329-14345.

[19] Briand E, Gu C, Boujday S, et al. Functionalisation of gold surfaces with thiolate SAMs: Topography/bioactivity relationship—A combined FT-RAIRS, AFM and QCM investigation [J]. Surf Sci, 2007, 601(18):3850-3855.

[20] Zhang Weiqi, Liu Jian, Tabata Y, et al. The effect of serum in culture on RNAi efficacy through modulation of polyplexes size [J]. Biomaterials, 2014, 35(1):567-577.

Anionic Polymer Coating Enhance the RNAi Efficiency of Non-Viral Carriers in Serum Containing Environment

Wang Jing Xie Lifei Meng Jie Liu Jian#*Xu Haiyan#*

(InstituteofBasicMedicalSciencesChineseAcademyofMedicalSciences,SchoolofBasicMedicinePekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China)

The clinical application of cationic polymer carriers was limited because the adsorption of protein in serum environment led to low transfection efficiency. In this work, we synthesized carboxylic Dextran (Dex-COOH) and water-soluble carboxylic fullerene (C60-Dex-COOH) anionic polymers, coated on the pullulan-spermine and siRNA complex (PS/siRNA) to reduce the adsorption of serum protein. The particle size and Zeta potential were analyzed by DLS/ELS, respectively. The formation of anion coating and bovine serum albumin (BSA) adsorption of complexes were tested by QCM-D. Cellular uptake, cytotoxicity on the Hela cells and RNAi efficiency on the Hela-EGFP cells were examined by cck-8 reagent and flow cytometry. The results showed that Dex-COOH and C60-Dex-COOH could coat on PS/siRNA to form stable electronegative complexes, prevent the adsorption of serum effectively. Cytotoxicity of complexes was reduced in the absence of serum. On the other hand, in the serum environment, anionic polymer coated complexes could help complexes enter cells and PS/siRNA@C60-Dex-COOH with visible light irradiation would escape from the lysosome, increased the interference efficiency by 20% compared with PS/siRNA. In summary, this coating strategy provided an effective solution of increasing RNAi efficiency mediated by cationic polymers.

cationic polymer; siRNA carrier; anionic coating; protein adsorption; RNA interference

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 04.008

2016-03-21， 录用日期:2016-05-10

国家自然科学基金(81271688)；国家重大科学研究计划(2011CB933504)

R318

A

0258-8021(2016) 04-0445-08

# 中国生物医学工程学会高级会员(Senior member, Chinese Society of Biomedical Engineering)

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: liujian@ibms.pumc.edu.cn；xuhy@pumc.edu.cn