上调miR-101对结肠癌细胞株的增殖、侵袭、迁移及化疗敏感性的作用

2016-02-23 01:00陈乐高崔盈
现代实用医学 2016年9期
关键词:细胞株结肠癌试剂盒

陈乐高,崔盈

·讲座与综述·

上调miR-101对结肠癌细胞株的增殖、侵袭、迁移及化疗敏感性的作用

陈乐高,崔盈

目的研究miR-101在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达水平及其对HT-29和RKO结肠癌细胞株增殖、侵袭和迁移的作用。方法采用聚合酶链式反应(PCR)检测42对结肠癌组织与癌旁正常组织中miR-101的表达情况;利用重组miR-101腺病毒上调结肠癌细胞株HT-29和RKO中miR-101的表达,克隆形成试验检测其对细胞增殖的影响,迁徙试验检测其对细胞迁移能力的影响,侵袭实验检测其对细胞侵袭能力的影响,并用噻唑蓝(MTT)检测相对增值率以及对5-氟尿嘧啶(5-FU)和顺铂(DDP)的化疗效果影响。结果miR-101在结肠癌组织中表达降低,上调miR-101的表达能够抑制结肠癌细胞株HT-29和RKO的增殖,降低其迁徙和侵袭能力,上调miR-101的表达能够增强5-FU和DDP对结肠癌细胞株HT-29的杀伤作用。结论miR-101在结肠癌组织中表达降低,上调miR-101的表达对结肠癌细胞具有抑制增殖和降低侵袭能力的作用,miR-101可能对结肠癌化疗效果有协同作用。

结肠癌;miR-101;细胞增殖;细胞迁徙;侵袭;化疗

结肠癌是一种常见的消化道肿瘤,由于肿瘤生长迅速,早期转移、化疗耐药等原因使得结肠癌患者的生存率难以提高[1]。microRNA(miRNA)是一种由约22个核苷酸构成的单链非编码RNA分子,它能与靶基因mRNA的3'-UTRs结合,导致转录后沉默[2]。异常表达的miRNA,如miR-1260b[3]、miR-195-5p[4]等在结肠癌的疾病发生发展中起到重要作用。已有研究表明miR-101与乳腺癌[5]、肺癌[6]及卵巢癌[7]等疾病相关,在结肠癌中的表达情况及生物学功能尚不清楚。本研究主要分析miR-101在结肠癌中的表达及其对细胞株生物学行为的影响,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料收集浙江省人民医院2015年4—12月收治的42例新鲜结肠癌手术切除标本及癌旁正常组织(距肿瘤组织5 cm以上),术前均未接受过放化疗,且术后病理诊断明确。其中男26例,女16例;年龄43~87岁,中位年龄57岁。肿瘤位置:左半结肠22例,右半结肠10例;病例类型:管状腺癌29例,腺癌13例;TNM分期:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期36例,Ⅳ期6例。新鲜组织标本切除后,冻存于-80℃超低温冰箱中。

1.2材料结肠癌细胞株HT-29和RKO购自上海细胞库;TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司;OneStepPrimeScriptmiRNA cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqTMII定量PCR试剂盒购自TAKARA公司;重组miR-101腺病毒(Ad-miR-101)和重组EGFP腺病毒(Ad-EGFP)由浙江省胃肠病重点实验室合成[8];迁徙试剂盒(TranswellsChamberassays)购自美国BD公司;侵袭试剂盒(Boyden Chambers assays)购自美国Millipore公司。

1.3结肠癌组织及癌旁组织中miR-101的检测

1.3.1总RNA提取和反转录按RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。利用miRNAcDNA SynthesisKit进行逆转录反应,反应体系:2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 l,0.1%PBS 2 l,miRNA PrimeScrip RT Enzyme Mix 2l,Total RNA 1 l,RNase Free dH2O 5 l;反应条件:37℃60 min,85℃5 s。

1.3.2实时荧光定量PCRmiR-101的正向特异性引物序列为:5’TACAGTACTGTGATAACTGAA3’,内参U6B的正向特异性引物序列为:5’ACGCAAATTCGTGAAGCGTT3’;反向引物为逆转录试剂盒中提供的通用引物。PCR反应体系:SYBRPremix 10 l,Rox 0.4 l,正反向引物各0.5 l,模板1 l,dH2O 7.6 l;反应条件:94℃4min,1个循环;94℃5s,55℃20 s,72℃20 s,40个循环;熔解曲线程序:95℃1min,55℃30s,95℃30s,1个循环。miR-101的相对表达量计算公式为2-△ct,△ct=Ct(miR-101)-Ct(U6B)。

1.4HT-29和RKO细胞株中重组miR-101腺病毒的感染取对数生长期HT-29和RKO细胞接种于6孔板中(细胞浓度2×105个/孔)。将Ad-miR-101作用于细胞(感染指数=100),作为实验组;将Ad-EGFP作用于细胞,作为对照组。感染24h后,利用qRT-PCR检测感染效果及进行细胞实验。

1.5细胞克隆试验将200个实验组和对照组细胞种植于6孔板上,每5天更换一次培养基。培养2周以后,集落用100%的甲醇固定15 min,然后用Giemsa染色液染色,最后进行计数。

1.6迁徙试验采用24孔的Transwells Chamber试剂盒,上室中加入200l含有4×104个细胞的DMEM培养基(不含牛血清),下室中加入含30%牛血清的DMEM培养基。经过24 h孵化,黏附于膜下层表面的细胞被固定,染色后拍照计数。

1.7侵袭试验利用Matrigel Invasion chamber试剂盒,在上室中加入300 l不含牛血清DMEM培养基,将5×105实验组和对照组细胞悬于其中;把含30%牛血清的500l DMEM基质作为下层胶质,创造一个趋化梯度。经过48 h孵化,细胞固定染色P拍照计数。

1.8噻唑蓝(MTT)试验收集上述实验组和对照组细胞,调整细胞浓度为2×103个/ml。将细胞悬液接种于96孔板中,培养过夜后分别加入PBS(5 l)或5-FU(5 g/ml)或顺铂(1 g/ml),恒温箱孵育24、48、72h,每孔加入20 lMTT液(5 mg/ml),继续培养4 h后取出培养板。吸净上清液,每孔加入150 lDMSO,振荡15min。以630nm为参考波长,570 nm为测定波长,用多功能酶标仪测定每孔的吸光度(A)。设加入PBS的对照组细胞株为空白对照组,按以下公式计算相对增值率。相对增殖率(%)=实验组(A 570 nm-A 630 nm)/空白对照组(A570nm-A630nm)×100%。

1.9统计方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差表示,配对计量资料采用配对样本t检验;等级资料采用2或Fisher确切概率检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1miR-101在结肠癌组织中表达降低结肠癌组织中miR-101的相对表达量(7.40±1.22)×10-2,显著低于癌旁正常组织(1.31×10-1±3.11×10-2),差异有统计学意义(t=14.677,P<0.05)。

2.2Ad-miR-101对miR-101表达的影响qRT-PCR的检测结果表明感染了Ad-miR-101的实验组的HT-29和RKO细胞株的miR-101相对表达水平(6.75×10-2±2.14×10-4、7.32×10-3±8.01×10-4)相对于对照组(3.06×10-3±9.70×10-4、2.73×10-3±1.21×10-3)明显上调(t=4.701、19.413,均P<0.05)。

2.3miR-101对HT-29和RKO细胞增殖的影响上调miR-101对结肠癌细胞HT-29和RKO的增殖有明显的抑制作用,过表达miR-101的HT-29细胞的克隆形成能力(90.3±7.23)较对照组明显降低(145.7±25.2);过表达miR-101的RKO细胞的克隆形成能力(24.5±4.2)较对照组明显降低(52.8±7.9),差异均有统计学意义(t=14.900、46.697,均P<0.05)。

2.4miR-101对结肠癌细胞迁徙、侵袭的影响过表达miR-101的细胞的迁徙侵袭能力较对照组明显减弱,HT-29细胞的迁徙能力和侵袭能力分别下降了约45.3%和50.4%(t=37.863和19.234,均P<0.05);RKO细胞的迁徙能力和侵袭能力下降了约33.3%和60.1%(t=6.239、53.642,均P<0.05)。

2.5miR-101对结肠癌细胞增殖及化疗药物敏感性的影响培养24、48、72 h后,HT-29细胞相对增殖率分别为(87.3±7.74)%、(76.4±5.63)%、(72.9±8.15)%(P<0.05);RKO细胞相对增殖率分别为(82.5±6.26)%、(78.1±3.78)%、(75.3±4.17)%(P<0.05)。加入小剂量的5-FU培养24、48、72 h后,HT-29细胞实验组的增值率[(38.7±6.53)%、(25.6±3.11)%、(22.1±5.97)%]显著低于对照组的增值率[(43.2±4.89)%、(25.9±4.73)%、(23.5±2.87)%](t≥9.726,均P<0.05)。在加入小剂量顺铂24、48、72 h后,HT-29细胞株实验组的增值率[(48.5±5.32)%、(23.6±5.99)%、(23.9±8.67)%]显著低于对照组的相对增殖率[(52.3±3.26)%、(27.8±6.12)%、(29.6±4.84)%](t≥4.675,均P<0.05)。HT-29细胞株在加入小剂量的5-FU和顺铂后,实验组和对照组的相对增值率差异均无统计学意义(均P>0.05)。

3 讨论

miRNA的异常表达和人类多种肿瘤的发生和发展有着密切的联系,如胃癌、肾癌及肝癌等[9]。最近研究表明,miRNA作为癌基因或者抑癌基因参与结肠癌的发生和发展过程中。如Tang等[10]研究表明,miR-345能够通过调节结肠癌细胞甲基化水平来抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭。Eyking等[11]研究发现在结肠黏液腺癌中,miR-373刺激异常有丝分裂和细胞形态学变化导致癌症发生和发展;miR-205能够促进KLF4、MUC2和 TGF 1的分泌,从而导致化疗耐药。

miR-101是近年才被研究的miRNA分子,目前关于miR-101肿瘤的报道基本上认为它是抑癌基因。Long等[12]发现miR-101在膀胱癌细胞中表达降低,它可以抑制膀胱癌细胞株T24的增殖和侵袭,进一步实验表明其调控的靶基因为c-FOS。Lei等[13]证实miR-101可以抑制PRDM16基因的表达,破坏星形细胞瘤线粒体功能,从而诱导细胞凋亡。Goto等[14]研究发现,miR-101在舒尼替尼耐药的肾细胞癌组织中表达降低,进一步实验表明miR-101能够抑制Caki-1和786-O细胞的迁徙和侵袭,miR-101直接调控UHRF1信号通路,UHRF1的过表达已经被证实和舒尼替尼耐药密切相关。此结果与本文结果有相似之处。本研究证实,miR-101在结肠癌组织中表达降低,上调了miR-101表达的HT-29和RKO细胞,生长速度明显减慢,侵袭和迁徙的能力减弱。

化疗是治疗结肠肿瘤的重要手段之一,然而细胞耐药一直是困扰结肠癌患者治疗的一个巨大难题。科学家们努力在寻找一种药物能够帮助解决这个问题,MicroRNA作为化疗辅助用药逐渐成为研究的热点。Liu等[15]研究证明,miR-203在结肠癌组织及结肠癌细胞系中表达都降低,它可以抑制SIK2的表达来增强结肠癌细胞对紫杉醇的化疗敏感。Hu等[16]研究发现,miR-205在乳腺癌耐药细胞株中表达降低,上调miR-205的表达能够显著提高这两个细胞株对多柔比星和紫杉醇的化疗敏感性。Zhu等[17]发现在顺铂耐药的胃癌患者中,miR-20a在肿瘤标本和血浆中表达增高。上调miR-20a抑制CYLD的表达,诱导NF B信号通路,激活下游基因livin和survivin,导致细胞耐药。本研究证明,miR-101能够抑制结肠癌细胞的增殖,在HT-29细胞株中,miR-101显著增加了化疗药物5-FU和顺铂对细胞的杀伤作用;然后在RKO细胞株中,化疗药物的作用却没有被miR-101显著增强。这可能是与细胞株的生物学行为区别、药物敏感度差异及药物作用机制不同等原因相关,需要进一步验证。

综上所述,本研究证实,miR-101在结肠癌组织中表达降低,上调miR-101的表达对结肠癌细胞具有抑制增殖和降低侵袭能力的作用,还能够增强5-FU和顺铂对结肠癌细胞株HT-29的杀伤作用。笔者推测,miR-101可能成为结肠癌治疗的一个新靶点。

[1]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J].CACancerJClin,2015,65(2):87-108.

[2]Barteild P.MicroRNAs:genomics,biogen esis,mechanism,andfunction[J].Cell,2004,2:281-297.

[3]LiuDR,GuanQL,GaoMT,etal.miR-1260b is apotential prognosticbiomarkerincolorectalcancer[J].MedSciMonit,2016,22:2417-2423.

[4]Luo Q,Zhang Z,Dai Z,et al.Tumor-sup pressive microRNA-195-5p regulates cell growth and inhibits cell cycle by targeting cyclin dependent kinase 8 in colon cancer[J].AmJTransl Res,2016,8(5):2088-2096.

[5]Li JT,Jia LT,Liu NN,et al.MiRNA-101 inhibitsbreast cancer growthand metastasis by targeting CX chemokine receptor 7[J].Oncotarget,2015,6(31):30818-30830.

[6]LvP,ZhangP,LiX,etal.Microribonucleic acid(RNA)-101 inhibits cell proliferation and invasion of lung cancer by regulating cyclooxygenase-2[J].ThoracCancer,2015,6:778-784.

[7]ZhengHB,ZhengXG,LiuBP.miRNA-101 inhibitsovariancancercellsproliferationand invasionbydown-regulatingexpressionofSOCS-2[J].IntJClinExpMed,2015,8(11):20263-20270.

[8]WangHJ,RuanHJ,HeXJ,etal.MicroRNA-101 is down-regulatedingastriccancerandinvolved in cell migration and invasion[J]. Eur J Cancer,2010,46(12):2295-2303.

[9]Thind A,Wilson C.Exosomal miRNAs as cancer biomarkers and therapeutic targets[J].JExtracell Vesicles,2016,5:31292.

[10]TangJT,WangJL,DuW,et al.MicroRNA 345,amethylation-sensitivemicroRNAis involved in cell proliferation and invasion in human colorectal cancer[J].Carcinogenesis,2011,32(8):1207-1215.

[11]EykingA,ReisH,FrankM,etal.MiR-205 and miR-373 are associated with aggressive human mucinous colorectal cancer[J].PLoS One,2016,11(6):e0156871.

[12]LongY,WuZ,YangX,etal.MicroRNA-101 inhibitstheproliferationandinvasionofbladder cancer cells via targeting c-FOS[J].Mol MedRep,2016,14(3):2651-2656.

[13]Lei Q,Liu X,FuH,et al.miR-101reverses hypomethylation of the PRDM16 promoter to disrupt mitochondrial function in as trocytoma cells[J].Oncotarget,2016,7(4): 5007-5022.

[14]Goto Y,Kurozumi A,Nohata N,et al.The microRNA signature of patientswithsunitinibfailure:regulationofUHRF1pathways by microRNA-101 in renal cell carcinoma[J].Oncotarget,2016.[Epubaheadofprint].

[15]LiuY,GaoS,ChenX,etal.Overexpression of miR-203 sensitizes paclitaxel(Taxol)-resistant colorectal cancer cells through target ingthesalt-induciblekinase2(SIK2)[J].Tumour Biol,2016.[Epub ahead of print].

[16]Hu Y,Qiu Y,Yagüe E,et al.miRNA-205 targets VEGFA and FGF2 and regulates resistance to chemotherapeutics in breast cancer[J].CellDeathDis,2016,7(6):e2291.

[17]ZhuM,ZhouX,DuY,et al.miR-20a induces cisplatin resistance of a human gastric cancercelllineviatargetingCYLD[J].Mol Med Rep,2016,14(2):1742-1750.

(本文编辑:陈志翔)

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.09.046

R363

A

1671-0800(2016)09-1215-03

310014杭州,浙江省人民医院

崔盈,Email:ing313 @126.com

2016-03-01

猜你喜欢
细胞株结肠癌试剂盒
农药残留快速检测试剂盒的制备方法及其应用研究
试剂盒法制备细胞块的效果及其技术要点
斑蝥素酸镁对人肝癌细胞株SMMC-721转录组的影响
MicroRNA-381的表达下降促进结肠癌的增殖与侵袭
基于CLSI-M43国际标准改良的Mycoview-AST试剂盒检测性能评估
腹腔镜下横结肠癌全结肠系膜切除术的临床应用
结肠癌切除术术后护理
稳定敲低MYH10基因细胞株的建立
腹腔镜下结肠癌根治术与开腹手术治疗结肠癌的效果对比
Rab27A和Rab27B在4种不同人肝癌细胞株中的表达