过表达Numb基因对人膀胱癌5637细胞周期和增殖的影响*

司马晋， 张 保△， 艾 青， 王保军， 马 鑫 ， 张 旭

(1.航天中心医院泌尿外科, 北京 100049； 2.解放军总医院泌尿疾病重点实验室， 北京 100053)

过表达Numb基因对人膀胱癌5637细胞周期和增殖的影响*

司马晋1， 张 保1△， 艾 青2， 王保军2， 马 鑫2， 张 旭2

(1.航天中心医院泌尿外科, 北京 100049； 2.解放军总医院泌尿疾病重点实验室， 北京 100053)

目的：探讨Numb基因对人膀胱癌细胞周期和增殖能力的影响及相关机制。方法: 选取人膀胱癌细胞5637为研究对象，采用Numb-ORF表达质粒转染细胞为实验组，设置阴性对照和空白对照组。采用荧光定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹技术检测各组中Numb基因和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达；采用流式细胞技术检测各组的细胞周期；采用酶标仪检测细胞在490nm的吸光度值，评价各组细胞的增殖活力。结果： 实验组Numb的△CT值为1.58±0.41，阴性对照组为5.66±0.53，空白对照组为5.81±0.47，差异有统计学意义(F=77.39，P=0.00)；实验组Cyclin D1的△CT值为4.92±0.73，阴性对照组为2.59±0.33，空白对照组为2.45±0.26，差异有统计学意义(F=11.70，P=0.01)。实验组中G0/G1期细胞的比例(%)为49.76±7.07，明显高于阴性对照组的36.52±3.32和空白对照组的38.21±2.06，差异有统计学意义(F=7.17，P=0.03)。增殖实验中，实验组24 h的吸光度值为0.35±0.08，明显低于阴性对照组0.52±0.06和空白对照组0.55±0.04(F=9.03,P=0.02)。 结论： Numb基因可以提高G0/G1期细胞比例，抑制膀胱癌细胞增殖，其机制可能是通过抑制Cyclin D1表达实现。

膀胱肿瘤； Numb基因； 细胞周期蛋白D1

膀胱癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤，病理类型以尿路上皮癌最常见，近年来膀胱癌的发病率逐年升高[1-2]。肿瘤的发生发展是一个多因素多阶段的过程，包括抑癌基因失活、癌基因活化以及细胞生物学功能的异常改变，在各种细胞生物学功能的变化中，细胞周期紊乱所致的异常细胞增殖是恶性肿瘤的共同特点[3-4]。Numb基因是新近发现的细胞命运决定因子，参与了多种人类肿瘤的发生发展[5-6]。本课题组前期研究发现Numb基因上调可以降低膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力[1]。本研究中我们将在前期基础上，使用质粒转染技术上调膀胱癌细胞中Numb基因的表达，检测细胞周期和细胞增殖的变化，以及对细胞周期素D1(Cyclin D1)表达的影响，探讨Numb基因在膀胱癌细胞周期和增殖中的作用及可能的相关机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人膀胱癌细胞5637由北京大学航天临床医学院实验室保存。使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)，37℃常规培养。取对数生长期细胞实验。

1.2 分组与处理

Numb-ORF表达质粒、空载体pCMV6-Entry和转染试剂Mega Tran 1.0购自美国Origene公司。实验分为三组：实验组(转染Numb-ORF)、阴性对照组(转染空载体)和空白对照组。具体操作见前期文献[1，7]。转染后48h收集细胞进行实验。

1.3 检测目的基因表达

使用ABI- 7500荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪检测目的基因的mRNA表达：以PPIA (peptidylprolyl isomerase A)为内参，采用相对定量比较CT值法分析数据[8]。Numb的上游引物：5’-CTTTTACAAGAGAAGGATCATTCCG-3’，下游引物：5’-CAACGACTATCTTATCTGTTTCAGC-3’；Cyclin D1的上游引物：5’-CCCTCGGTGTCCTACTTCAA- 3’，下游引物：5’-AGGAAGCGGTCCAGGTAGTT- 3’；PPIA的上游引物：5’-ATGGTCAACCCCACCGTGT- 3’，下游引物：5’-TCTGCTGTCTTTGGGACC TTGTC- 3’。使用蛋白质印迹检测各目的基因蛋白质表达强度，Numb、Cyclin D1和内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的一抗购自英国Abcam公司，按1 ∶1 000稀释后使用。二抗购自北京中杉金桥公司，按1 ∶2 000稀释后加入，具体操作步骤参照文献[1,7]。

1.4 检测细胞周期

收集各组细胞，以70%乙醇固定12小时，加入1毫升碘化丙啶染色液(上海碧云天公司)染色后流式细胞仪检测，并计算增殖指数(proliferation index,PI)=(G2/M+S)/(G0/G1+S+G2/M)，实验独立重复3次。

1.5 检测细胞增殖能力

实验前在96孔板中以2 000个细胞/孔密度铺板，检测时每孔加入MTS试剂(美国Promega公司)20μl，37℃孵育1小时后酶标仪检测490nm吸光度值(A490)，比较三组的细胞活力，实验独立重复3次。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 各组中Numb基因的表达水平

实验组的△CT值为1.58±0.41，阴性对照组为5.66±0.53，空白对照组为5.81±0.47，差异有统计学意义(F=77.39，P=0.00)。蛋白质印迹检测可见实验组Numb表达强度明显强于两对照组(图1)，提示转染Numb-ORF质粒可以上调膀胱癌5637细胞中Numb的表达水平。

图1 蛋白印迹检测目的基因表达

2.2 各组中Cyclin D1的表达水平

实验组的△CT值为4.92±0.73，阴性对照组为2.59±0.33，空白对照组为2.45±0.26，差异有统计学意义(F=11.70，P=0.01)。根据PCR实验原理，循环数(CT值)越大则表示该基因的表达量越低。蛋白质印迹检测可见实验组中Cyclin D1的表达强度较对照组降低(图1)。

2.3 上调Numb表达对细胞周期的影响

流式细胞仪分析显示，实验组中G0/G1期细胞的比例(%)为49.76±7.07，明显高于阴性对照组的36.52±3.32和空白对照组的38.21±2.06，差异有统计学意义(F=7.17，P=0.03)。同时，实验组的S期细胞比例和增殖指数均降低(P<0.05，表1，图2)。这表明上调Numb基因可以增加G0/G1期细胞比例，减少S期细胞比例，降低细胞的增殖指数。

表1 流式细胞技术检测各组细胞

2.4 上调Numb表达对细胞增殖的影响

实验组在24 h的吸光度值为0.35±0.08，明显低于阴性对照组0.52±0.06和空白对照组0.55±0.04(F=9.03,P=0.02)；同样，实验组在48 h和72 h的吸光度也明显低于两对照组，差异有统计学意义(P=0.01，表2)。根据MTS法的实验原理，在490nm的吸光度(A490)值与活细胞的数量呈线性关系，即A490值越大则代表的活细胞数量越多。这表明实验组的细胞增殖减弱。

图2 流式细胞技术分析各组细胞周期分布图

组别0h24h48h72h实验组0.18±0.040.35±0.080.68±0.160.92±0.31阴性对照组0.16±0.030.52±0.061.24±0.232.02±0.36空白对照组0.17±0.020.55±0.041.38±0.181.96±0.27F值0.319.0311.1311.53P值0.740.020.010.01

3 讨 论

膀胱癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤，发病率长期位居我国泌尿系统恶性肿瘤的首位[9-10]。近年来，随着社会工业化程度提高和环境污染等因素，膀胱癌的发病率仍在逐年提高[2]。临床上不同TNM分期的膀胱癌患者，预后差别很大[9-10]。在TNM分期中，T分期是衡量肿瘤体积大小的指标，而肿瘤的大小与肿瘤细胞的增殖能力是密切相关的。因此，研究Numb基因对膀胱癌细胞周期和增殖能力的影响，将有助于从分子水平认识膀胱癌发生发展的原因，有益于膀胱癌患者的临床治疗和预后。

现有研究表明，肿瘤的形成与进展是多因素交互的结果，基因学的改变在其中发挥了重要作用[11-12]。Numb基因是新近发现的肿瘤相关基因，广泛存在于从果蝇到哺乳动物及人类的各层级生物体内[1，6]。前期研究发现，Numb蛋白的不同表达强度决定了子代细胞不同的分化命运，因而Numb基因被定义为细胞命运决定因子[5]。目前已有多篇研究报道发现Numb基因的异常表达参与了人类肿瘤的发生发展。Rennstam等[13]利用免疫组化技术检测241例乳腺癌组织标本发现乳腺癌中Numb表达降低，并且减低程度与乳腺癌的侵袭性相关，提示Numb在乳腺癌中可能发挥抑癌因子作用。Wu等[14]对肝细胞癌中的Numb基因进行研究，发现在肝癌病理组织中Numb基因高表达，且高表达的Numb基因与患者的不良预后具有相关性，提示Numb基因在肝癌中可能发挥促癌作用。根据前期文献我们发现在不同类型的肿瘤中Numb基因的生物学作用不尽相同，有时作为抑癌因子，有时发挥促癌作用，因此Numb基因在膀胱癌中的作用尚须明确。本研究在前期工作基础上，通过Numb基因对人膀胱癌细胞周期和增殖能力的影响，进一步探讨Numb基因在人膀胱癌中的作用和相关机制。

恶性肿瘤共性的生物学特点是细胞周期紊乱所致的异常细胞增殖，同时细胞增殖强度也影响着肿瘤的大小和以此为依据的临床T分期[15]。Cyclin D1是一个负责细胞周期调控的重要蛋白质，其表达与细胞增殖密切相关[16]。生理情况下，Cyclin D1负责调控细胞由G1期进入S期；当Cyclin D1表达过量时，会促使G1期细胞向S期转化，缩短细胞周期，加速增殖，这也是肿瘤组织迅速生长的原因之一。Lima等[16]研究发现Cyclin D1在膀胱癌病理组织中表达升高，而且其表达量与肿瘤的大小、分期、分级等临床指标呈统计学相关性，降低Cyclin D1表达水平将有利于膀胱癌患者获得更好的预后转归。本研究中我们使用体外质粒转染技术，在膀胱癌5637细胞中过表达Numb基因，检测细胞周期和增殖活力的变化。我们发现过表达Numb基因可以促使膀胱癌细胞的G0/G1期比例升高，降低S期比例，抑制肿瘤细胞的G1/S期转化，减低细胞增殖指数。众所周知，S期是细胞DNA的合成期，是为细胞有丝分裂进行遗传物质准备的时期，处于S期细胞的比例降低意味着能够进行有丝分裂增殖的细胞减少[4]。在细胞增殖实验中我们也观察到，实验组细胞的增殖活力显著低于对照组。

为了进一步探讨Numb基因对膀胱癌细胞周期和增殖调控的可能机制，我们检测了与增殖相关的细胞周期蛋白 D1的表达，结果显示实验组中Cyclin D1的表达下降。Flores等报道了Numb基因可以与膜受体Notch信号相互作用，抑制Notch信号通道的活化及下游效应因子的表达[17]。我们前期在膀胱癌的研究中已证实：Notch信号的活性是通过介导细胞核转录因子Hes1从而向下传导影响下游的效应分子表达[10]。同时也有文献证实，Cyclin D1就是Notch信号通道下游的效应因子之一[18]。因此，综合这些间接证据我们可以推论Numb基因可抑制Notch信号通路的活化，受抑制的Notch信号可影响Cyclin D1的表达。由此我们预测Numb基因似乎是通过Notch信号通路途径抑制了Cyclin D1的表达，影响细胞周期和抑制细胞增殖，今后我们将继续研究证实这一观点。综上，本研究发现Numb基因可以负性调节Cyclin D1的表达促使膀胱癌细胞发生G0/G1期阻滞，抑制细胞增殖，提示Numb基因在膀胱癌中可能发挥抑癌基因作用，有可能成为新型的肿瘤标志物或潜在的抗肿瘤药物靶点。

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Effect of Numb Gene on Cell Cycle and Proliferation in Human Bladder Cancer 5637 Cells*

Sima Jin1, Zhang Bao1△, Ai Qing2, et al

(1.DepartmentofUrology,AerospaceCenterHospital,Beijing100049,China； 2.KeyLaboratoryofUrologicalDiseases，GeneralHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy，Beijing100053,China)

Objective: To study the effect of Numb gene on cell cycle and proliferation in human bladder cancer cells and its related mechanism. Methods: Human bladder cancer 5637 cells which were transfected by the Numb-ORF plasmid were used as the experimental group. The negative control and blank control were also set. The expression of Numb or Cyclin D1 was detected by Real-Time PCR and Western Blot. The cell cycle was analyzed by Flow cytometry. Cell proliferation was assessed by comparing with absorbance at 490nm using a Micro-plate Reader. Results: Compared with the negative control (5.66±0.53) and blank control (5.81±0.47), the △CTvalue of Numb in the Numb-ORF group (1.58±0.41) was significantly lower (F=77.39，P=0.00). Meanwhile, the △CT value of Cyclin D1 in the Numb-ORF group (4.92±0.73) was significantly higher than that in the negative control (2.59±0.33) and blank control (2.45±0.26) (F=11.70，P=0.01). The ratio (%) of G0/G1cells was as follows: Numb-ORF group was 49.76±7.07, negative control was 36.52±3.32 and blank control was 38.21±2.06 (F=7.17，P=0.03). In proliferation assay, compared with negative control (0.52±0.06) and blank control (0.55±0.04), the OD value at 24h in Numb-ORF group (0.35±0.08) was significantly reduced (F=9.03,P=0.02). Conclusion: Numb gene could promote G0/G1phase arrested and inhibit proliferation of bladder cancer cells, the suppressive effects may be due to down-regulation of Cyclin D1.

Bladder Neoplasm; Numb Gene; Cyclin D1

2015- 10- 09

2016- 01- 09

*国家自然科学基金(81100561)

司马晋，男，山西运城人，硕士研究生，主治医师，主要研究方向：泌尿系肿瘤的基础和临床研究。

△张 保，主任医师，E-mail:baoztj@sina.com

R737.14；R730.2

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.01.001

•应用基础研究•