维生素C对肉鸡缺氧肺动脉平滑肌细胞缺氧诱导因子-1α转录水平的影响

曹　林，曾秋凤，张克英，丁雪梅，白世平，罗玉衡，王建萍，玄　玥，宿卓薇

(四川农业大学动物营养研究所，教育部动物抗病营养重点实验室，雅安 625014)



维生素C对肉鸡缺氧肺动脉平滑肌细胞缺氧诱导因子-1α转录水平的影响

曹林，曾秋凤*，张克英，丁雪梅，白世平，罗玉衡，王建萍，玄玥，宿卓薇

(四川农业大学动物营养研究所，教育部动物抗病营养重点实验室，雅安 625014)

摘要：旨在体外培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的基础上利用氯化钴(CoCl2)建立细胞缺氧模型，探讨维生素C(VC)对缺氧肉鸡PASMCs中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及其下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)mRNA转录的影响。选用21 d健康AA肉公鸡，分离、培养并鉴定PASMCs，利用CoCl2建立细胞缺氧模型，再用7个浓度的VC(0、50、100、200、500、1 000和1 500 μmol·L-1)，5个培养时间(6、12、24、48和72 h)处理，试验共设35个处理，每个处理6个重复。结果表明，利用组织块法可成功培养出肉鸡PASMCs；与对照组相比，不同浓度CoCl2均可使细胞缺氧基因(HIF-1α、VEGF、VEGFR2)转录量显著增加(P<0.05)，促进细胞增殖，250 μmol·L-1CoCl2处理48 h可成功建立肉鸡PASMCs缺氧模型；500或1 000 μmol·L-1VC处理48或72 h可显著降低缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGFR2 mRNA的转录(P<0.05)，而1 500 μmol·L-1VC则显著增加缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的转录(P<0.05)。结果提示，缺氧会导致肉鸡肺动脉平滑肌细胞缺氧基因表达量与细胞增殖增加，而VC能降低细胞对缺氧信号的敏感性，使缺氧基因的相对表达量降低。

关键词：肉鸡肺动脉平滑肌细胞；二氯化钴；缺氧；缺氧诱导因子-1α；维生素C

肉鸡腹水综合征(ascites syndrome，AS)又称肉鸡肺动脉高压综合征(pulmonary hypertension syndrome，PHS)，是快大型肉鸡三大主要营养代谢性病之一，己严重威胁到各国肉鸡的健康养殖及其福利，年经济损失超过10亿美元。研究发现缺氧是引发肉鸡AS的一个关键启动因子，缺氧导致肉鸡肺动脉血管重构[1]、肺动脉压升高、右心室肥大、自由基损伤等病理变化[2-3]。缺氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是机体感受缺氧信号传导的一个关键转录因子，其是由HIF-1α与HIF-1β两个亚基组成的异二聚体。HIF-1α是HIF-1所特有，受细胞氧浓度的密切调控，决定HIF-1的水平与活性。2006年，曾秋凤[4]研究证实，HIF-1α基因表达与肉鸡AS发生发展密切相关。2014年，杨夏(X.Yang)等[5]进一步利用低温诱导肉鸡AS的研究证实，HIF-1α及其下游目的基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及血管内皮生长因子受体2(VEGFR2/Flk-1)参与了腹水肉鸡的肺动脉血管重构，而饲粮添加VC能够下调AS肉鸡肺HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA 转录，降低肺动脉血管重构。但其分子机制目前尚未见研究报道。

肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增殖导致的肺动脉重构是肉鸡AS发生的关键病理环节[6]。有研究发现肉鸡肺血管重构与肺细小动脉平滑肌细胞的过度增殖和凋亡减少有关[7]。缺氧是诱发肉鸡肺血管重构与肺细小动脉平滑肌细胞过度增殖的关键启动因子。氯化钴(CoCl2)作为一种诱导剂，可与HIF-1α中的氧依赖降解区结合诱发细胞缺氧，从而用于体外培养细胞缺氧模型的构建[8]。大量研究已利用CoCl2建立缺氧环境并应用于体外神经细胞[9]、癌细胞、血管内皮及平滑肌细胞的研究[10]及奶牛子宫内膜平滑肌细胞[11]研究。2014年，李彬彬[11]研究发现，CoCl2的作用时间和作用浓度与HIF-1α mRNA转录量呈现正相关。因此，本试验旨在体外原代培养肉鸡PASMCs，利用CoCl2建立细胞缺氧模型，初步探讨维生素C对肉鸡缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA转录的影响，为进一步研究VC调控HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA转录的分子机制奠定基础。

1材料与方法

1.1主要试验试剂与仪器

生物安全柜(Thermo1300Series)、倒置显微镜(Nikon TS100)、二氧化碳培养箱(Thermo3111)、照相系统(Nikon DS-Ri1)、ABI 7900型荧光定量PCR仪、DMEM-F12培养基(HyClone)、南美洲胎牛血清(Sigma)、胰蛋白酶(HyClone)、青链霉素(HyClone)、D-hanks液(武汉博士德)、TritonX-100(Sigma)、鼠抗α-actin抗体(武汉博士德)、羊抗鼠抗体(武汉博士德)、CoCl2·6H2O(Sigma)、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(武汉博士德)。

1.2试验动物

30只21日龄健康AA肉公鸡。

1.3肉鸡肺动脉平滑肌细胞分离培养与鉴定

1.3.1原代、传代细胞培养和纯化(组织贴块法)试验参照2002年董世山等[12]和2009年李锦春等[13]的方法并加以摸索改进。原代培养时，当组织块贴上培养瓶瓶底4 h后翻转培养瓶，加入3 mL完全培养液(20%胎牛血清+1%青链霉素+79%DMEM-F12)培养。每2～3 d换液一次。

当细胞生长铺满瓶底80%时进行细胞传代培养和纯化。加入1 mL·瓶-10.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA室温消化3 min，然后立即加入5 mL完全培养液，终止消化。再用移液枪轻轻吹打细胞培养区使细胞完全脱离瓶底。然后按照1∶2(每瓶3 mL细胞悬液)接种至新的培养瓶继续培养。一般传至3代可以得到纯净的PASMCs，最多可传至6～7代。

1.3.2细胞鉴定

1.3.2.1细胞形态学鉴定：用倒置显微镜，在100倍和200倍下对细胞进行观察。

1.3.2.2 细胞免疫荧光染色鉴定：试验参照2009年李锦春等[13]方法进行。添加抗体孵育时，先滴加一抗(鼠抗α-actin抗体，1∶200稀释)，室温孵育1～2 h，D-hank’s液洗3次，每次5 min。再滴加二抗(生物素标记羊抗小鼠抗体，1∶100稀释)，室温静置30 min，D-hank’s液洗3次，每次5 min。滴加SABC-Cy3(1∶100稀释)，湿盒室温静置30 min，D-hank’s液洗3次，每次5 min。梯度酒精脱水。荧光显微镜下观察，拍照。

1.4CoCl2缺氧模型的建立

1.4.1CoCl2处理试验设计6×4因子设计，即6个CoCl2浓度(0、100、200、250、500和1 000 μmol·L-1)，将CoCl2溶于灭菌的超纯水中，配成100 mmol·L-1的母液，0.22 μm滤膜过滤，再用培养基(DMEM-F12，1∶1)调节CoCl2母液为以上浓度；4个时间水平(6、12、24和48 h)，试验共计24个处理，每个处理6个重复。

1.4.2CoCl2处理样品收集相应时间点按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，-80 ℃保存，用于缺氧基因相对表达量检测。

1.4.3肉鸡PASMCs细胞增殖检测细胞增殖检测方法参考2012年陶绍能等[14]和王静等[15]进行。重复对细胞做CoCl2处理后，待测孔在每个时间点加入10 μL 5 mg·mL-1的MTT溶液，在细胞培养箱中继续孵育4 h。每孔加入100 μL formanzan溶解液，在细胞培养箱中继续孵育，直到在光学显微镜下观察发现formazan全部溶解，约4 h。利用SpectraMax M2 在570 nm测定吸光度。

1.5VC对肉鸡缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA转录的影响

1.5.1VC处理试验设计试验采用7×5因子设计，7个VC浓度(0、50、100、200、500、1 000和1 500 μmol·L-1)，将VC溶于灭菌的超纯水中，配成10 mmol·L-1的母液，0.22 μm过滤，再用培养基(DMEM-F12，1∶1)调节VC母液为以上浓度，5个培养时间(6、12、24、48和72 h)，试验共计35个处理，每个处理6个重复。

1.5.2VC处理样品收集同CoCl2处理试验。

1.6RT-PCR检测

利用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒和ABI Prism7900 sequence detection system进行RT-PCR检测。反应采用10 μL体系，冰上操作，体系包括：5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ+0.4 μL Forward Primer+ 0.4 μL Reverse Primer+0.2 μL ROX Reference+3 μL dH2O+1μL cDNA。反应条件：95 ℃预变性30 s，再40个循环(95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s)，最后进行熔解曲线检测(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s)。引物序列见表1。

表1引物序列

Table 1The sequence of primers

1.7数据处理

缺氧基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法[16]计算：ΔCt(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)；ΔΔCt=Ct(试验组)-Ct(对照组)。目的基因的相对表达量=2-ΔΔCt。用GraphPad Prism 5作图。用SAS 9.0做单因素分析，分析CoCl2和VC对缺氧基因转录的影响，以P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著。

2结果

2.1肉鸡肺动脉平滑肌细胞的鉴定

2.1.1 形态学鉴定在倒置相差显微镜下观察，组织块贴壁5～6 d后，逐渐有细胞从组织块周围爬出贴壁伸展，多数细胞伸展呈长梭形，细胞质丰富。细胞平行排列成单层，或部分区域多层重叠生长，高低起伏，表现为PASMCs典型的“峰-谷”状生长特点(图1)。

2.1.2免疫荧光染色鉴定肉鸡PASMCs染色

后，α-SM-actin的免疫荧光显示，细胞质中有较多与细胞纵轴相平行的丝状物，呈现红色荧光，即为平滑肌细胞特有的肌动蛋白(图2)。肉鸡PASMCs的染色阳性率占95%以上。

2.2CoCl2诱导肉鸡PASMCs缺氧对HIF-1α mRNA转录及细胞增殖的影响

2.2.1HIF-1α mRNA转录量不同浓度CoCl2在不同时间处理下肉鸡PASMCs的HIF-1α mRNA的转录见图3。时间和CoCl2浓度对HIF-1α mRNA的转录的主效应显著(P<0.05)。CoCl2各浓度处理6 h，其HIF-1α mRNA的转录均很低，0、100、200 μmol·L-1CoCl2处理12和24 h，其HIF-1α mRNA的转录也较低。用250、500和1 000 μmol·L-1CoCl2处理12、24、48 h后，其HIF-1α mRNA的转录均显著增加(P<0.05)，其中以250 μmol·L-1CoCl2处理48 h最高。

2.2.2细胞增殖不同浓度CoCl2不同处理时间下，肉鸡PASMCs的细胞增殖情况如图4。时间对细胞增殖的主效应极显著(P<0.01)。随着CoCl2浓度增大，细胞增殖降低。随着处理时间增加，细胞增殖增加，48 h最大(P<0.01)。

2.2.3CoCl2处理肉鸡PASMCs中VEGF和Flk-1基因的转录CoCl2浓度为0、250和1 000 μmol·L-1下处理48 h，细胞VEGF和Flk-1的mRNA相对转录量如图5和6。当CoCl2浓度250和1 000 μmol·L-1下处理48 h时，细胞VEGFmRNA相对转录量均有高于CoCl2浓度为0 μmol·L-1处理的趋势；细胞Flk-1 mRNA转录量均高于CoCl2浓度为0 μmol·L-1的处理，但差异不显著。CoCl2处理时缺氧基因(HIF-1α、VEGF、Flk-1)的相对转录量及细胞增殖变化表明，建立肉鸡PASMCs缺氧模型的最佳 CoCl2处理条件为250 μmol·L-148 h。

2.3VC对肉鸡缺氧PASMCsHIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA转录的影响

CoCl2诱导肉鸡肺动脉平滑肌细胞缺氧后添加不同浓度VC，不同时间处理下肉鸡PASMCsHIF-1α 、VEGF、VEGFR2 mRNA的相对转录量交互效应见图7，主效应见图8和图9。

由图7可看出，随着VC浓度和处理时间增加，HIF-1α与VEGFR2 mRNA的相对转录量下降。与0 μmol·L-1+6 h处理组相比，VEGFR2的全部处理组以及HIF-1α除50、100 μmol·L-1+6 h和0、1 500 μmol·L-1+24 h处理组mRNA的相对转录量都极显著降低 (P<0.01)。但与0 μmol·L-1+6 h处理组相比，VEGFmRNA的相对转录量，200、500、1 000 μmol·L-1+6、12 h组和1 500 μmol·L-1+72 h组极显著升高(P<0.01)，而50 μmol·L-1+24 h组、 0、50、100 μmol·L-1+48 h组、1 000 μmol·L-1+72 h组显著降低(P<0.05)，0、50、100 μmol·L-1+72 h组降低水平达到极显著(P<0.01)，与其他处理组差异不显著。

由图8可以看出，随着处理时间的增加HIF-1α mRNA的相对转录量降低，在12 h时最低，达到显著水平(P<0.05)，其次是48和72 h，也显著低于6和24 h(P<0.05)，其靶基因VEGF、VEGFR2 mRNA的相对转录量呈现出一致的变化趋势，都随着处理时间的增加而降低，在72 h时达到最低值，但较48 h不显著，较其他处理时间显著(P<0.05)。表明，VC最佳的处理时间为48或72 h。

由图9可以看出，当VC浓度为500或1 000 μmol·L-1，HIF-1α mRNA的相对转录量较低，与其他浓度组相比达到显著差异(P<0.05)，其靶基因VEGFR2 mRNA的相对转录量呈现出与HIF-1α较为一致的趋势。但是VEGFmRNA的相对转录量在VC浓度为50 μmol·L-1时略有降低，之后随着VC浓度的升高总体上升高，在200 μmol·L-1时达到显著升高的水平 (P<0.05)。与其他VC浓度组相比，1 500 μmol·L-1VC显著增加了HIF-1α、VEGFR2 mRNA转录量(P<0.05)。表明，VC最佳的处理浓度为500 或1 000 μmol·L-1。

3讨论

3.1肉鸡PASMCs原代细胞的培养

本试验结果显示，组织块贴壁5～6 d后，逐渐有细胞从周围爬出，呈长梭形，7～10 d后细胞铺满80%瓶壁。这与2002年董世山等[12]应用组织贴块法、贴块配合差速贴壁法培养不同日龄鸡的肺动脉平滑肌细胞发现结果一致。

本试验通过细胞免疫荧光法对平滑肌细胞特有的α-actin肌动蛋白染色，发现细胞质中有较多与细胞纵轴相平行的丝状物呈现红色荧光，即为平滑肌细胞特有的肌动蛋白。这与2009年李锦春等[13]利用组织贴块法培养1～10 d肉鸡PASMCs的结果一致。证明本试验成功培养出21 d肉鸡PASMCs。

3.2CoCl2诱导缺氧模型的建立及HIF-1α、VEGF、VEGFR2基因的转录

目前，细胞缺氧模型的建立通常有物理缺氧法和化学缺氧法。通过调节三气培养箱中氧气和氮气的比例(一般为5%CO2+3%O2+92%N2或5%CO2+95%N2)来造成缺氧环境效果比较理想，但培养箱价格昂贵。化学法主要是通过添加化学试剂(如氰化物或CoCl2)诱导细胞缺氧。氯化钴通过影响HIF-1α亚基的表达来影响HIF-1的表达，从而建立缺氧环境并与HIF-1的表达形成浓度依赖性[17，18]。2003年，K.Zhang等[19]研究进一步指出，利用CoCl2模拟细胞缺氧时HIF-1α基因表达上调表明细胞缺氧环境的成功建立。本试验发现通过CoCl2可以明显提高肉鸡PASMCs中HIF-1α基因的转录，当用250 μmol·L-1CoCl2处理48 h时，肉鸡PASMC的HIF-1α mRNA转录量最大，细胞增殖状态良好。因此将250 μmol·L-1CoCl2处理48 h作为建立肉鸡PASMCs缺氧模型的可靠条件。

研究发现，肉鸡发生AS时肺动脉血管发生细胞生长和迁移[1]。VEGFmRNA的相对表达量在平滑肌细胞缺氧后数小时内明显提高，在恢复供氧后又降低到正常水平，说明缺氧导致细胞VEGF基因表达量提高，造成细胞增殖与迁移[20]。G.T.Stavri等[21]报道缺氧能显著上调氧浓度和时间依赖的兔血管平滑肌细胞VEGFmRNA的稳态水平，0%O2处理12～24 h后达到峰值，与对照组相比增加了30倍。1998年，H.Christou等[22]报道指出缺氧肺动脉平滑肌细胞VEGF及其受体VEGFR2的基因表达显著增加。

同样，在本研究中CoCl2浓度为250和1 000 μmol·L-1处理48 h后，细胞VEGFR2 mRNA转录量均高于CoCl2浓度为0 μmol·L-1的处理。该结果与本课题组前期研究发现低温组肉鸡肺缺氧相关基因转录规律基本一致[5]，表明缺氧导致肉鸡PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的转录量增加。

3.3VC对缺氧PASMCs中HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA转录的影响

VC作为一种强抗氧化剂和脯氨酸羟化酶的辅助因子，对人类或鼠类肿瘤细胞HIF-1α基因及其活性有着较强的调控作用。本试验研究发现，50～500 μmol·L-1VC使缺氧PASMCs中HIF-1α mRNA的相对转录量显著降低，对VEGF、VEGFR2 mRNA转录量的影响也呈现出一致的趋势。这与2003年H.J.Knowles等[23]的研究报道相一致。众多体外试验结果表明，HIF-1α的表达及活性受细胞内氧化还原状态和脯氨酸羟化酶活性的影响[24]。用50 μmol·L-1H2O2可刺激人肺动脉血管平滑肌细胞HIF-1α蛋白和mRNA表达增加，而用抗氧化剂N-乙酰胱氨酸(5 mmol·L-1)处理，可使HIF-1α蛋白和mRNA表达量分别下降85.8%和94.4%[25]。正常给氧条件下培养PC3 细胞中加入1 mmol·L-1MMOG (dimethyloxalylglycine，一种脯氨酸羟化酶的抑制剂)可上调HIF-1α蛋白的表达。细胞内VC缺乏会使脯氨酸羟化酶活性丧失，HIF-1α蛋白降解受到抑制，从该酶的Km值推测出细胞内VC浓度在140～260 μmol·L-1之间时该酶的活性最佳[26-27]。

VC是否通过抗氧化和提高脯氨酸羟化酶活性来调控肉鸡缺氧PASMCs中HIF-1α及其下游靶基因的表达，有待进一步研究。本试验发现，随着VC浓度的提高，VEGF的相对转录量总体上呈上升趋势。这可能是由于VEGF表达受上游转录因子，如HIF-1α、癌基因Ras等，以及诸多其他因素，如细胞因子，转化生长因子(TGF)，内皮生长因子(EGF)、肝素等共同调控[28]，但其具体原因也有待进一步探讨。

此外，本试验还发现，1 500 μmol·L-1的VC则使HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的相对转录量显著增加，尤其是HIF-1α和VEGFR2 mRNA的相对转录量极显著地高于其他处理组。这可能是由于过高剂量VC的添加对细胞产生了毒性作用，增加了细胞对缺氧刺激的敏感性[29]，反馈性地促进了缺氧相关基因的表达。

4结论

利用组织块贴壁法可成功培养21 d肉鸡肺动脉平滑肌细胞。250 μmol·L-1CoCl2处理48 h可成功建立肉鸡PASMCs缺氧模型；缺氧导致肉鸡PASMCs 显著增殖和HIF-1α、VEGF、VEGFR2 mRNA的相对转录量增加。浓度为500、1 000 μmol·L-1的VC处理48、72 h，可降低缺氧状态下肉鸡PASMCsHIF-1α、VEGF、VEGFR2基因的转录；而高剂量(1 500 μmol·L-1)VC可能会对细胞产生毒性作用，反馈性地上调上述基因的表达。

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(编辑白永平)

Effects of Vitamin C on the Transcription of Hypoxia Inducible Factor-1α of Broiler Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells under Hypoxia

CAO Lin，ZENG Qiu-feng*，ZHANG Ke-ying，DING Xue-mei，BAI Shi-ping，LUO Yu-heng，WANG Jian-ping，XUAN Yue，SU Zhuo-wei

(KeyLaboratoryofAnimalNutritionforDiseaseResistanceintheMinistryofEducation，InstituteofAnimalNutrition，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

Key words:broiler pulmonary artery smooth muscle cells；CoCl2；hypoxia；HIF-1α；VC

Abstract:This study was conducted to investigate the effects of Vitamin C (VC) on hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α)，vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor 2 (VEGFR2) mRNA transcription of broiler pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs)under hypoxia induced by CoCl2.PASMCs from healthy AA broilers at 21 days of age were isolated，cultured and identified.A cell model of hypoxia was established by using CoCl2.On this basis，PASMCs were treated by 7 different concentrations of VC (0，50，100，200，500，1 000 and 1 500 μmol·L-1) and 5 processing time (6，12，24，48 and 72 h)，total 35 treatments with six replicates.The results indicated that the PASMCs of broilers were successfully separated and culturedinvitro.As for hypoxia model of PASMCs，the relative transcription ofHIF-1α，VEGF，VEGFR2 and cell proliferation capacity significantly increased when PASMCs were after 48 h treatment by CoCl2with 250 μmol·L-1(P<0.05).The relative transcription ofHIF-1α，VEGFR2 in hypoxia PASMCs were significantly decreased by VC with 500 or 1 000 μmol·L-1after 48 or 72 h (P<0.05).Whereas 1 500 μmol·L-1VC significantly increased the relative transcription ofHIF-1α，VEGF，VEGFR2 in hypoxia PASMCs (P<0.05).These results suggested that anoxia could up-regulate the relative expression of hypoxia related genes and induce abnormally proliferation of PASMCs.While VC could reduce the sensitivity to oxygen signals of hypoxia PASMCs，and further down-regulate the relative expression of hypoxia related genes.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.024

收稿日期：2015-07-02

基金项目：国家自然科学青年基金(31101733)；四川农业大学211双支计划

作者简介：曹林(1990-)，男，四川绵阳人，硕士生，主要从事家禽营养与饲料研究，E-mail：1315522048@qq.com *通信作者：曾秋凤，研究员，博士，主要从事家禽营养与饲料研究，E-mail：zqf@sicau.edu.cn

中图分类号：S852.2

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0388-09