GP5Δ84-119稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

王晓红，宋林林，李亮亮，袁传奇，姜　博，周恩民*，穆　杨*

(1.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；2.农业部兽用药物与兽医生物技术陕西省科学观测实验站，杨凌 712100)



GP5Δ84-119稳定表达对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响

王晓红1，2，宋林林1，2，李亮亮1，2，袁传奇1，2，姜博1，2，周恩民1，2*，穆杨1，2*

(1.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；2.农业部兽用药物与兽医生物技术陕西省科学观测实验站，杨凌 712100)

摘要：为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构蛋白GP5的第二胞外区在病毒复制中的作用及机制，利用PiggyBac Transposon System Vectors构建了表达删除84—119氨基酸残基的截短型GP5的重组质粒(pPB-GP5Δ84-119)，转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆，筛选稳定表达GP5Δ84-119的Marc-145细胞系，并利用cck-8试剂盒检测细胞的增殖情况；用PRRSV SD16株感染筛选的细胞，通过病毒基因拷贝数和病毒滴度检测GP5Δ84-119表达对PRRSV复制影响；通过Real-time PCR和ELISA检测病毒感染前后细胞IFN-α、IFN-β、IFN-γ的表达情况。经RT-PCR、Western blot和IFA检测，GP5Δ84-119在Marc-145细胞中获得稳定表达，将此细胞命名为Marc-145-GP5Δ84-119；细胞增殖曲线显示GP5Δ84-119的表达不影响细胞的增殖；对病毒基因拷贝数和病毒滴度检测发现GP5Δ84-119的表达可以抑制PRRSV的复制，这种抑制作用可能是通过上调IFN特别是IFN-β的表达而实现的。研究表明GP5第二胞外区在PRRSV复制中发挥重要作用。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；GP5Δ84-119；稳定表达；复制；干扰素

The Effect of GP5Δ84-119Stable Expression on the Replication of

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又名猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)感染所致的一种高度接触性传染病。该病以繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染为主要特征，是当今世界对养猪业经济影响最重要的疾病之一。PRRS于1987年首先在北美洲被发现并报道，随后该病在加拿大、德国、荷兰等国家及地区相继暴发，目前已呈全球性分布。S.J.Tousignant等对2009—2013年4 年间美国14 个猪场371个猪群PRRS发病率和时空动态分析显示，PRRSV在美国的危害仍持续存在[1]。1996年郭宝清等首次分离到PRRSV中国株CH-1a[2]。之后该病在我国的流行和分布日益广泛，给我国养猪业造成了巨大的经济损失，特别是2006年主要由高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)变异株引起的高致病性PRRS (HP-PRRS)给我国养猪业造成的打击几乎是毁灭性的[3-6]。鉴于该病对我国养猪业的巨大危害，农业部现已将其列为一类动物疫病。由于PRRSV的嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用(antibody-dependent effect，ADE)和持续性感染等特征，目前对该病的致病机制和免疫机制仍不完全清楚，现有疫苗防控PRRSV感染的效果也不理想。

PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，为有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒基因组长度约为15 kb，由9个相互重叠的开放阅读框(open reading frame，ORF)组成，其5′末端有帽子状引导序列，3′末端有Poly(A)尾序列，从5′端到3′端依次为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7[7]。ORF1 由ORF1a 和ORF1b 组成，位于基因组的5′端，约占整个基因组的80%，主要编码病毒RNA复制酶和聚合酶。ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4和ORF5依次编码糖基化的囊膜蛋白GP2a、E、GP3、GP4和GP5[8]，ORF6和ORF7分别编码膜基质蛋白(matrix protein，M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)[9]。ORF5编码的GP5是PRRSV的一种糖基化囊膜蛋白，相对分子质量约为25 ku，具有高度变异性，美洲型毒株和欧洲型毒株的GP5分别由200和201个氨基酸残基组成。成熟的GP5由氨基端信号肽(1-31 aa)、胞外区、三次跨膜的疏水区和位于胞质中的亲水性羧基端组成[8，10-12]。GP5在病毒的组装、入侵和诱导机体产生免疫应答方面发挥着重要作用。三次跨膜的GP5 在病毒囊膜上形成两个胞外区，美洲型毒株位于第一胞外区氨基端的44和51 位(在LV是46和53位)的糖基化位点在不同毒株间高度保守。在LV毒株，46位天冬酰胺(Asn)的糖基化对病毒的组装和感染性是必要的，但Asn 53的糖基化似乎并不重要。有关第二胞外区与病毒复制的关系，目前还未见相关报道。本研究通过建立稳定表达缺失84-119氨基酸残基(第二个胞外区)的截短型GP5的Marc-145细胞系，研究GP5Δ84-119表达对PRRSV复制的影响及机制，为进一步研究GP5的功能及PRRSV的致病机制积累资料。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1病毒、质粒、载体和细胞PRRSV SD16株(GenBank Access No.JX087437.1)、Marc-145细胞系由西北农林科技大学兽医免疫生物学实验室保存；pMD18-T-GP5、pMD18-T-N质粒，Marc-145-GP5、Marc-145-GFP细胞系由西北农林科技大学兽医免疫生物学实验室构建、鉴定并保存；E.coliDH5α感受态细胞、pMD18-T载体购自TaKaRa公司；PiggyBac transposon vector system为SBI公司产品。

1.1.2主要试剂质粒提取试剂盒、胶纯化试剂盒为北京全式金生物技术公司产品，RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real time)、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、ExTaqVersion 2.0 plus dye为TaKaRa公司产品，T4 DNA连接酶、BamHⅠ、EcoRⅠ为NEB公司产品，FastStart Universal SYBR Green Master为Roche公司产品，PageRuler Prestained Protein ladder、BCA蛋白质测定试剂盒为Thermo Scientific公司产品，X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent为Roche公司产品，嘌呤霉素(puromycin)为Merck公司产品，HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG、TRITC-conjugated Affinipure Goat Anti-swine IgG为Jackson ImmunoResearch公司产品，Cell counting kit-8(cck-8)为碧云天生物技术公司产品，抗α-tubulin单克隆抗体为Sigma公司产品，抗PRRSV GP5小鼠血清、抗PRRSV N蛋白单克隆抗体6D10、抗PRRSV猪阳性血清由西北农林科技大学兽医免疫生物学实验室制备并保存；Monkey Interferon α(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ ELISA kit (Catalog# CSB-E10040Mo、CSB-E17829Mk、CSB-E110049Mo) 为CUSABIO公司产品。

1.2引物设计合成与重组质粒构建

参照PRRSV SD16株GP5编码序列利用Primer 5.0设计引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列见表1。采用PCR方法从pMD18-T-GP5质粒上分别用引物GP51-83-F与GP51-83-R、GP5120-201-F与GP5120-201-R扩增编码GP5 1—83和120—201氨基酸残基所对应的基因序列片段，胶回收PCR产物，再采用Overlap PCR方法以编码GP5 1—83和120—201氨基酸残基的基因序列片段为模板，用引物GP5-F和GP5-R扩增编码GP5Δ84-119(删除84—119氨基酸残基的GP5)的序列片段。胶回收目的片段，将目的片段与PB transposon plasmid用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后回收、连接、转化E.coliDH5α感受态细胞、培养挑取单克隆，将菌液PCR和双酶切鉴定为阳性的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序正确的质粒命名为pPB-GP5Δ84-119(图1)。

表1引物信息

Table 1The information of primers

下划线部分为EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点序列

The underlined areEcoRⅠ andBamHⅠ restriction enzyme sequences

1.3质粒转染与细胞筛选

将状态良好的Marc-145细胞按每孔2×105个细胞铺于6孔细胞培养板培养，待细胞达到80%左右融合度时用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent 将donor plasmid (pPB-GP5Δ84-119或PB Transposon vector)和helper plasmid(PiggyBac Transposase vector)转染细胞，同时设仅转染PB Transposon vector的对照。转染后24～48 h观察。若仅转染PB Transposon vector的孔无荧光，而其他孔均有荧光，则更换新鲜培养液并向培养液中加入终质量浓度为10 ng·μL-1的嘌呤霉素开始进行筛选培养，每2 d更换一次含嘌呤霉素的培养液，大约10 d左右在荧光显微镜下看到带绿色荧光的细胞团出现时连续进行3次亚克隆，将获得的表达绿色荧光的单克隆细胞及时进行冻存。然后更换为无嘌呤霉素的培养液培养并进行外源基因表达检测。

1.4筛选细胞的鉴定

1.4.1RT-PCR鉴定收获正常培养的筛选细胞，用RNAiso plus提取细胞总RNA，取1 μg RNA 用PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录为cDNA，以获得的cDNA为模板用GP51-83-F和GP5120-201-R进行PCR扩增，同时设Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP对照。反应结束后取5 μL PCR产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统分析结果。

1.4.2Western blot鉴定收集1×106个正常培养的筛选细胞，按NP40裂解液说明裂解细胞准备样品进行12%分离胶 SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白质转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，PBST洗膜后将膜转入抗PRRSV GP5小鼠血清(0.5 ng·μL-1)或抗α-tubulin单克隆抗体(0.25 ng·μL-1)中4 ℃孵育过夜，次日洗膜后将膜放入HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(0.08 ng·μL-1)中，室温孵育1 h，洗膜后用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(TianGen)显色并记录结果。同时设Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP对照。

1.4.3激光共聚焦显微镜分析将筛选细胞与Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP按1×104·孔-1分别接种于铺有爬片的24孔细胞培养板，培养24 h后用4%多聚甲醛室温固定细胞15 min，冷PBS洗3次后用含0.3%Triton X-100、1% BSA的PBS室温透膜3 min，洗涤后用含5% BSA的PBS室温封闭1 h，洗涤后以抗PRRSV 阳性猪血清(1∶300稀释)为一抗室温孵育细胞2 h，洗涤，以TRITC-conjugated Affinipure Goat Anti-swine IgG(70 ng·μL-1)为二抗室温孵育1 h，PBS洗1次，然后用DAPI染细胞核2 min，PBS洗3次，双蒸水洗1次，Fluorescence mounting medium(Dakota，CA，USA)封片，激光共聚焦显微镜(Nikon A1R，Japan)观察，同时设Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP对照。

将RT-PCR、Western blot和激光共聚焦显微镜分析均为阳性的细胞命名为Marc-145-GP5Δ84-119。

1.5细胞增殖曲线测定

用培养液调整Marc-145-GP5Δ84-119浓度，每孔2×103个细胞接种96孔板培养，分别于培养的24、48、72、96、120、144和168 h在每个测定点前2 h，每孔加入10 μL cck-8溶液，轻轻混匀后继续培养2 h，用酶标仪读取450 nm波长处吸光度值，每个时间点设置6个重复孔，同时设Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP对照。

1.6PRRSV GP5Δ84-119表达对病毒复制影响检测

将Marc-145-GP5Δ84-119按5×104·孔-1接种于24孔细胞培养板培养，待细胞融合度达到80% 时，按0.1 MOI接种PRRSV SD16株，37 ℃吸附1 h 后换成3% FBS的DMEM维持液，接毒后12、24、36、48、60 h分别收集细胞和培养液上清，每个时间点设3个重复。用RNAiso plus提取细胞总RNA，取500 ng RNA用PrimeScriptTMRT reagent kit反转录合成cDNA。以pMD18-T-N为标准品10倍稀释制作标准曲线，采用Real-time PCR对样品进行检测，参考标准曲线计算每个样品中N基因的拷贝数。将收集的培养液上清用不含血清DMEM作10倍稀释，按Reed-Muench法用Marc-145细胞测定培养液上清中的病毒滴度(TCID50mL-1)，同时设Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP对照。

1.7IFN-α、IFN-β、IFN-γ表达检测

1.7.1Real-time RT-PCR检测IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA水平将Marc-145-GP5Δ84-119按5×104·孔-1接种于24孔细胞培养板，待细胞融合度达到80% 时，按0.1 MOI接种PRRSV SD16株，37 ℃吸附1 h 后换成3% FBS的DMEM维持液，接毒后12、24、36、48 h分别收集细胞，通过Real-time RT-PCR检测各样品中IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA的转录情况，同时设Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP对照。

1.7.2IFN蛋白表达检测将Marc-145-GP5Δ84-119细胞按1×104·孔-1接种96孔细胞培养板，分别收集培养24和48 h的培养液上清，同时待细胞达80%融合度时按0.1 MOI接种PRRSV SD16株，37 ℃ 吸附1 h，更换为含3% FBS的DMEM维持液继续培养。收集接毒后24和48 h的培养液上清，每个时间点设3个重复。用Monkey IFN-α、IFN-β和 IFN-γ ELISA 试剂盒检测收集的培养液上清中各IFN蛋白的表达。

1.8数据处理

用GraphPad prism 5 对数据进行处理，P<0.05表示有显著差异，P<0.001表示有极显著差异。

2结果

2.1重组质粒构建

以pMD18-T-GP5质粒为模板，先分别扩增编码PRRSV GP5 1—83氨基酸残基和120—200氨基酸残基的基因片段，再以回收的目的片段为模板通过 Overlap PCR方法扩增编码删除84—119氨基酸残基的GP5基因片段(图2A)，回收目的片段与PB Transposon vector连接后构建重组质粒，通过菌液PCR和EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定(图2B)后测序结果显示，编码删除84—119氨基酸残基的截短型GP5基因片段被正确插入PB Transposon vector中(图2C)。

2.2稳定表达GP5Δ84-119细胞的筛选与鉴定

将pPB-GP5Δ84-119或PB Transposon vector 和PiggyBac Transposase vector共转染Marc-145细胞，转染后24 h观察到微弱的绿色荧光，48 h绿色荧光已比较明亮，72 h开始用含嘌呤霉素的培养液进行筛选培养，10 d左右时观察到带荧光的细胞团，经3次亚克隆后获得全部表达绿色荧光的细胞克隆(图3A)。采用RT-PCR方法可以从筛选的细胞中扩增到495 bp的目的条带，从Marc-145-GP5细胞中扩增到603 bp的GP5 基因片段，而Marc-145和Marc-145-GFP均无扩增条带(图3B)。Western blot结果显示，筛选细胞的泳道有20 ku左右的印迹条带，Marc-145-GP5细胞的泳道有25 ku左右的印迹条带，而Marc-145和Marc-145-GFP细胞的泳道均无条带(图3C)。激光共聚焦显微镜分析发现，与GP5一样，GP5Δ84-119主要表达于细胞质中(图4)。

筛选的细胞在无嘌呤霉素的培养液中连续传50代以上检测，目的基因的表达依然稳定。以上结果表明获得了稳定表达PRRSV GP5Δ84-119的Marc-145细胞系Marc-145-GP5Δ84-119。

2.3Marc-145-GP5Δ84-119增殖测定

采用cck-8试剂盒检测细胞的增殖状况，结果显示，与Marc-145和Marc-145-GFP相比，稳定表达GP5Δ84-119对Marc-145细胞的增殖无明显影响，从细胞接种到对数生长期，Marc-145-GP5Δ84-119的增殖与Marc-145和Marc-145-GFP无差异，仅培养到120 h以后，Marc-145-GP5Δ84-119比Marc-145和Marc-145-GFP早进入平台期(图5)。

2.4GP5Δ84-119稳定表达对PRRSV复制的影响

接种PRRSV SD16株后12、24、36、48和60 h分别收集细胞和培养液上清。提取细胞总RNA，以pMD18-T-N质粒为标准品，通过绝对实时荧光定量RT-PCR检测PRRSVN基因拷贝数。PRRSV感染后12 h，Marc-145-GP5和Marc-145-GP5Δ84-119细胞中N基因拷贝数略有增加，且与Marc-145细胞相比差异显著，但从感染后24 h直到检测的60 h，Marc-145-GP5Δ84-119细胞中N基因拷贝数显著低于Marc-145细胞中的 (P<0.05或P<0.01)(图6A)，培养液上清中的病毒滴度从感染后24 h也持续低于Marc-145和Marc-145-GFP细胞培养上清中的病毒滴度(P<0.05)(图6B)。表明GP5Δ84-119稳定表达可以抑制病毒的复制。

2.5IFN-α、IFN-β、IFN-γ表达检测

为了探究GP5Δ84-119稳定表达抑制PRRSV SD16株复制的可能原因，在病毒感染后12、24、36和48 h收集细胞，提取细胞总RNA，通过荧光定量RT-PCR检测各样品中IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA转录情况，并采用ELISA试剂盒检测病毒感染后24和48 h培养液中IFN-α、 IFN-β和 IFN-γ蛋白的含量。结果发现，与Marc-145细胞相比，病毒感染Marc-145-GP5Δ84-119后12 h，IFN-α、IFN-β的mRNA转录有所下降，IFN-γ mRNA转录变化不明显，到24和36 h，IFN-α(4.09倍和4.98倍)和IFN-β(10.18倍和10.02倍) mRNA转录均出现了大幅度升高，特别是36 h，IFN-γ(5.72倍)mRNA的转录也出现上调，但到48 h，仅检测到IFN-β(1.82倍)mRNA转录仍然处于上调状态(图7A)。检测IFN-α、IFN-β和 IFN-γ蛋白表达水平发现，与Marc-145细胞相比，正常培养48 h的 Marc-145-GP5Δ84-119细胞中，IFN-β蛋白水平升高明显，IFN-α和 IFN-γ在正常培养24和48 h都出现了不同程度的变化，但变化幅度较IFN-β均比较小；病毒感染后24和48 h，与Marc-145细胞和Marc-145-GFP细胞上清中IFN-β表达相比，Marc-145-GP5Δ84-119细胞上清中IFN-β蛋白表达一直维持在较高水平，由此推测IFN-β表达上调可能是GP5Δ84-119稳定表达抑制PRRSV复制的原因之一，是否还有其他因素导致GP5Δ84-119稳定表达抑制病毒复制，有待进一步研究。

3讨论

病毒感染敏感细胞包括吸附、侵入、脱壳、病毒成分合成、病毒粒子组装和释放等步骤。PRRSV感染 PAM 开始于与巨噬细胞膜上硫酸乙酰肝素(heparin sulphates，HS)、黏多糖(Glycosaminoglycans，GAGs)的结合，随后病毒通过 M/GP5 复合物与唾液酸黏附素(sialoadhesin，Sn)的氨基端结合，继而病毒受体复合物经网格蛋白介导的内吞作用被内化，然后病毒基因组从早期内体释放于细胞质并开始病毒的复制[13]。GP5、M 和 N 蛋白对病毒粒子的组装和释放是绝对必须的，但共表达 PRRSV 同科的马动脉炎病毒(equine arteritis virus，EAV)的 GP5、M 和 N 蛋白并不能在培养液中形成病毒样颗粒(virus-like particles，VLP)，说明其他非结构蛋白或宿主蛋白对病毒粒子的形成和释放是必须的[14]。缺少次要囊膜蛋白虽然可以形成病毒粒子，但形成的病毒粒子没有感染性[15]。GP5是一种糖基化囊膜蛋白，具有高度变异性，美洲型毒株和欧洲型毒株的GP5分别由200和201个氨基酸残基组成。成熟的GP5由氨基端信号肽(1—31 aa)、胞外区、三次跨膜的疏水区和位于细胞质中的亲水性羧基端组成[8，10-12]。位于美洲型毒株第一胞外区的44和51 位(在LV是46和53位)的糖基化位点在不同毒株间高度保守。46位天冬酰胺(Asn)的糖基化对LV毒株的组装和感染性是绝对必须的，但Asn 53的糖基化似乎并不重要[16]。对于GP5第二胞外区在病毒复制中的作用目前却鲜见报道。

本研究在预测PRRSV SD16 株GP5跨膜结构的基础上(图1)，构建表达删除GP5第二个跨膜区(aa 84-119)的重组质粒，在构建重组载体时，作者选择了PiggyBacTMTransposon Vector System，利用此载体构建的重组质粒转染细胞后，在转染细胞中表达的目的蛋白质与标签蛋白是分离的[17]，在分析目的蛋白质的功能时，不会受到标签蛋白的影响。用重组质粒转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆获得了稳定表达GP5Δ84-119的细胞系Marc-145-GP5Δ84-119，通过RT-PCR、Western blot和激光共聚焦显微镜检测，GP5Δ84-119在Marc-145细胞中获得了稳定表达。筛选的细胞在光学显微镜下与其祖代细胞Marc-145细胞形态相似(图3A)，Western blot检测时出现两条印记条带，这与报道的GP5蛋白存在不同的糖基化形式相一致[18-19]。 激光共聚焦显微镜检测表明，表达的GP5Δ84-119主要存在于细胞质中(图4)。利用Cell Counting Kit-8检测细胞的增殖情况表明，GP5Δ84-119稳定表达不影响Marc-145细胞的增殖(图5)。

作为 PRRSV 最主要的结构蛋白之一，GP5 在病毒的侵入、组装和诱导机体产生免疫应答等方面发挥着重要作用[15，20]。在课题组前期构建的稳定表达GP5全长的细胞系Marc-145-GP5上，GP5稳定表达在病毒感染早期可以通过下调 IFN(特别是IFN-β)的表达促进病毒的复制。在Marc-145-GP5Δ84-119上接种PRRSV SD16株后不同时间分别收集培养液上清和细胞，检测细胞中的病毒基因拷贝数和上清中的病毒滴度，发现除接毒后12 h病毒复制稍有增加外，一直到接毒后60 h，病毒的复制被明显抑制，细胞中PRRSVN基因拷贝数和上清中PRRSV滴度均显著低于Marc-145细胞和空载体对照Marc-145-GFP细胞的(图6)。研究报道，IFN-α、IFN-β和IFN-γ 具有抗PRRS病毒的效应[21-24]。本研究发现，与Marc-145细胞相比，PRRSV感染 Marc-145-GP5Δ84-119后，IFN-α、IFN-β、IFN-γ mRNA转录在24和48 h均出现不同程度的上调，IFN-β蛋白表达也显著升高(图7)，由此推测干扰素特别是IFN-β表达的上调可能是GP5Δ84-119稳定表达抑制PRRSV复制的原因之一。Z.Wei等指出GP5蛋白胞外区存在的N连接的糖基化位点对病毒在体内的复制至关重要[25]。aa 84-119 包括了GP5蛋白的第二个胞外区和部分胞内区 (图1)。稳定表达删除此区域的截短型GP5，PRRSV在此细胞上的复制被显著抑制，此区域是否也存在一些关键的氨基酸位点在病毒的复制中发挥重要作用以及是否还有其他因素发挥了GP5Δ84-119稳定表达抑制PRRSV复制的作用，还有待进一步研究。

4结论

构建了表达删除84—119氨基酸残基的 PRRSV GP5(GP5Δ84-119)的重组质粒，转染Marc-145细胞筛选到稳转细胞系Marc-145-GP5Δ84-119，GP5Δ84-119在Marc-145细胞中的稳定表达可以抑制PRRSV SD16株的复制，IFN表达的上调可能是GP5Δ84-119稳定表达抑制病毒复制的原因之一。

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(编辑白永平)

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

WANG Xiao-hong1，2，SONG Lin-lin1，2，LI Liang-liang1，2，YUAN Chuan-qi1，2，JIANG Bo1，2，ZHOU En-min1，2*，MU Yang1，2*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.ScientificObservingandExperimentalStationofVeterinaryPharmacologyandVeterinaryBiotechnology，MinistryofAgriculture，Yangling712100，China)

Key words:porcine reproductive and respiratory syndrome virus；GP5Δ84-119；stable expression；replication；interferon

Abstract:This experiment was conducted to study the role of the second extracellular domain of glycoprotein 5，one major structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)，on PRRSV replication and approach to its mechanism in Marc-145 cells.A recombinant plasmid (named as pPB-GP5Δ84-119) expressing truncated GP5 was constructed using PiggyBac Transposon System Vectors and transfected to Marc-145 cells.Marc-145 cell line stably expressing GP5Δ84-119was obtained by puromycin resistance screening and triple subcloning and the selected cells proliferation was detected using cck-8 kit.The effect of GP5Δ84-119stable expression on PRRSV replication were determined thought detection of virus gene copy number in the infected cells and virus titers in the supernatant of infected cells.What’s more，the mRNA and protein expression levels of IFN-α，IFN-β，IFN-γ in the cells before and after PRRSV infection were also analyzed using Real-time PCR and ELISA.The results of RT-PCR，Western blot and IFA confirmed that GP5Δ84-119was stablely expressed in Marc-145 cells and the cells were named as Marc-145-GP5Δ84-119.The result of cell proliferation assay confirmed that the expression of GP5Δ84-119did not affect the proliferation of Marc-145 cells.It was found that GP5Δ84-119expression inhibited the replication of highly pathogenic PRRSV in Marc-145 cells through upregulating IFN level，especially IFN-β.These findings suggest that the second extracellular domain of GP5 plays an important role in PRRSV replication.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.02.014

收稿日期：2015-06-20

基金项目：国家自然科学基金青年项目(31201883)；中央高校基本科研业务费(2014YB010；2452015318)

作者简介：王晓红(1988-)，女，陕西宝鸡人，硕士生，主要从事重大动物疫病发病机制研究，Tel：029-87091117，E-mail：13152427862@163.com *通信作者：周恩民，E-mail：zhouem@nwsuaf.edu.cn；穆杨，E-mail：muyang@nwsuaf.edu.cn

中图分类号：S852.659.6

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)02-0315-10