奶牛的早期妊娠诊断研究进展

包 凯，曹 宇，刘光磊*，安朋朋，孙先枝，黄 健，李福全

（1.上海奶牛育种中心有限公司，上海 200436；2.黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319）

奶牛的早期妊娠诊断研究进展

包 凯1，曹 宇2，刘光磊1*，安朋朋1，孙先枝1，黄 健1，李福全1

（1.上海奶牛育种中心有限公司，上海 200436；2.黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319）

奶牛早期妊娠诊断一直以来是奶牛养殖亟待解决的问题，特别是近年来奶牛养殖业飞速发展，奶牛早期妊娠诊断更加影响着奶牛业的发展。简便高效的早期妊娠诊断技术对于提高奶牛繁殖效率具有重要意义，是提高牧场管理和经济效益的根本要求。本文对目前奶牛的临床早期妊娠诊断技术进行简要概述，以期为将来的早期妊娠诊断研究提供参考。

奶牛；早期妊娠诊断；繁殖效率；经济效益

1 前言

经过半个多世纪的艰辛发展，我国奶牛产业已经从传统、落后、粗放的养殖模式转变成规模化、标准化、精细化、产业化养殖的模式，很多先进技术也得到了大力的推广。我国奶牛的存栏量从20世纪90年代的12万头，发展至今已达到1 400万头左右[1]。随着奶牛存栏量的增加，畜牧业组织化水平进一步提高，奶牛的繁殖性能一直是兽医工作人员和相关科研人员关注的热点问题。

目前，对奶牛进行直肠检查或利用仪器设备等进行检测是奶牛妊娠诊断最主要的临床方法，但直肠检测法要在奶牛进行人工授精2个月后才能进行，如不能及时发现未孕的奶牛，会增加母牛的空怀时间而降低其经济效益。早期妊娠诊断不仅能够改善奶牛的繁殖情况、缩短产犊间隔、减少空怀时间，也对提高奶牛饲养的经济效益具有极为重要意义[2]。近年来，研究人员针对奶牛的早期妊娠诊断进行了诸多研究，以期寻找到快速、简便和经济的临床方法对奶牛早期妊娠情况进行诊断。

2 奶牛的早期妊娠诊断研究进展

2.1超声波诊断法超声波诊断是利用物理学原理与动物组织结构声学特质，将二者进行联合的一种诊断方法。主要原理是：通过高频声波对母畜的子宫进行检测，根据超声的回波放大后转化的信号不同来显示结果。利用该方法诊断的常用仪器主要有：A超、B超以及D超（多普勒超声），其中多普勒超声仪应用比较广泛。20世纪80年代末，我国应用仿制的A型测孕报警仪以及自行研发的兽用超声多普勒检测仪，先后开展了诸多对奶牛早期妊娠诊断的研究。郑星道等[3]于1988年采用SCD多普勒超声仪对483头母牛进行了早期妊娠诊断，结果表明，针对宫血流量的声音检测与妊娠的符合率在奶牛配种的16～30 d和31～50 d分别为93%和98%；而针对妊娠51～79 d的奶牛受孕和未受孕的检出率均为100%。陈兆英等[4]随后应用该仪器从直肠检测母畜宫血音的结果证实与直检结果一致。邓干臻等[5]于2004年使用B超对妊娠不同阶段的137头母畜进行检查，结果显示母畜配种后26～30 d妊娠确诊率为89%，而配种后的31～35 d的诊断准确率为97%，超于35 d的则为100%。

2.2早孕因子诊断法1983年Koch等[6]的研究报道中指出母畜在受孕后血液、乳汁中会出现早孕因子。早孕因子是是一种与妊娠相关的蛋白质复合物的简称，属于免疫抑制因子。研究证明，早孕因子是妊娠初期在母畜血液当中出现的，它在母体内避免免疫排斥的方法是通过抑制母畜的细胞免疫完成的，从而使胎儿正常存活。早孕因子诊断法主要是对早孕因子含量进行测定，从而将其作为早期妊娠诊断的一项重要指标。目前，主要采用硫酸铜检测法和玫瑰花环试验法对奶牛血液或乳汁样品进行早孕因子含量的检测。

玫瑰花环抑制试验一般在配种后数小时至数天内即可依据滴度进行检测，所以该试验不仅适用于早期妊娠诊断，也是妊娠后期判断胎儿是否存活的指示物之一。1981年，澳大利亚科学家已经开始用玫瑰花环抑制试验对奶牛早期妊娠进行诊断检测，妊娠奶牛的花环抑制滴度为2～18，而未妊娠奶牛滴度范围为6～10。李雅茹等[7]在1988年对66头奶牛利用该方法进行诊断，妊娠总检出率约88%。

硫酸铜检测法的主要检测原理是应用硫酸根试剂可以与早孕因子发生凝集反应的特性，从而对奶牛乳汁中早孕因子的含量进行测定。王应安等[8]在1996年利用硫酸铜检测法对人工授精40～60 d后的奶牛血液样本进行早孕因子进行检测，该检测结果与直肠检查结果相比较，其阳性准确率为88%，阴性准确率为87%。何勇军等[9]于2001年对21头配种后35～45 d奶牛乳样进行硫酸铜法检测怀孕和未怀孕的奶牛检出率均达到60%以上。

2.3血小板计数法血小板活化因子是指在母畜受孕后的受精卵，特别是在桑葚胚阶段产生的一种乙酰化的甘油磷脂。血小板活化因子能够引起不依赖于能量物质的释放，而产生血小板的凝集。处于胚胎阶段的血小板活化因子能够接到妊娠的母畜对胚胎的识别，并引起妊娠最初的反应，即血小板的减少。

以往的研究证实：配种7 d后怀孕的母牛血小板数量明显减少，而未妊娠的奶牛则没有明显的血小板数量变化[10]。在母牛配种前后根据血小板的数量变化，马群山等[11]对198头配种7～20 d的奶牛进行血小板数量的检测并将结果与配种后50d左右的直检结果进行比较，结果显示血小板计数法对怀孕和未怀孕的奶牛检出率分别达到81%和90%。

2.4血清酸滴定法怀孕母牛在妊娠过程中，在机体内会产生某种特有的在酸性环境中与其他蛋白质形成低溶性复合物的免疫球蛋白。据以往报道显示：利用血清素滴定法对该种免疫球蛋白的检测，能够达到对奶牛进行早期孕检的目的。1994年安翠华等[12]利用血清酸滴定法对配种后16～45 d的奶牛进行该免疫球蛋白的检测，结果证实利用该种免疫球蛋白进行早期妊娠诊断的准确率高达96%。2007年郑毛亮等[13]也对经配种后16～45 d的89头奶牛血清样品利用该方法进行检测，并与直肠检测结果比对，对未妊娠和妊娠的奶牛检出率分别达到了91%和89%。

2.5乳胶凝集抑制试验该检测方法属于一种免疫测定法。当精子和卵子结合转变为合子后，在母畜机体内发育为胚胎和胎盘，胚泡的绒毛膜滋养层细胞与胚盘的子叶均分泌类绒毛膜促性腺激素并随乳汁或黏液排出体外。对妊娠母畜的尿液和乳汁中该激素进行乳胶凝集抑制试验的检测，可以作为一种早期妊娠诊断的方法。凌志忠等[14]于1992年对两批奶牛进行乳胶凝集抑制试验（检测奶牛为配种后21～30 d），二批样品的受孕与空怀的准确率均超过86%。但1998年栾晓峰等[15]对妊娠4～8月的奶牛进行检测，均呈现阴性，结果表明依靠对类绒毛膜促性腺激素的检测方法准确性有待提高。

2.6宫颈--阴道黏液电导率测定法Aizinbudas等于1962即提出过利用电机插入奶牛阴道腔测定宫颈和阴道黏液电阻值或电导率，此后许多学者对该方法测定奶牛早期发情和妊娠诊断的可行性进行了分析。殷国荣等于1992年利用该方法对94头奶牛进行测定，结果表明，在妊娠早期和发情周期宫颈-阴道黏液的电导率呈现规律性变化。处于发情间期的健康母牛，该电导率处于低水平状态，从前情期开始至发情期逐渐上升，在发情后期开始下降至发情间期的水平；在发情期进行输精后，妊娠与空怀母牛的电导率变化规律具有明显不同。在发情周期的每一个阶段，妊娠母牛电导率明显低于未妊娠母牛，尤其是在输精21 d左右。研究显示进行人工授精后18～24 d的妊娠和空怀奶牛的电导率差异极显著，且对妊娠和未妊娠奶牛的检出率分别达到87%和93%[16]。当前，对母牛发情及早期妊娠的诊断仪主要使用MFR-1和CVMEC-A这两种型号，该诊断仪主要由主机、探测电极两部分组成，在临床使用中需将主机跨于胸前，而探测电极插入待检母牛的阴道穹窿部粘液中，之后工作人员读取电导率结果值，即可判定。

2.7碱性磷酸酶活力测定法碱性磷酸酶是一组酶类的总称，主要分布于小肠黏膜、肝脏、肾脏、骨和胎盘等组织器官中。许多报道证实：在母畜妊娠的桑葚胚阶段，体积较大且分裂较慢的细胞中含有碱性磷酸酶；胎盘也随着妊娠的进展而分泌该酶。以往的研究显示，在妊娠的母畜血液中碱性磷酸酶活力比未妊娠母牛高，通过测定该酶的活力将其作为妊娠检测的指标。伍先淑等[17]于1993年采集了发情期配种前的34头奶牛血液和36头配种后连续3个月且每月定时采集的3次血液样品，采用甘油磷酸法，利用分光光度计对血液样品进行碱性磷酸酶的测定，结果显示，在母牛妊娠第1个月，血清中的碱性磷酸酶活力有所增高，但与未妊娠奶牛相比差异不显著，至妊娠第2和第3个月时，二组差异显著且妊娠奶牛碱性磷酸酶活力明显逐月增高。

2.8放射免疫测定法放射免疫测定法（RIA）是将免疫反应原理与同位素的放射测量法相结合的微量分析方法。Laing等[18]首次在1971年提出利用此方法测定奶牛乳汁中的孕酮含量，以此对奶牛发情阶段和妊娠情况评估，并与直检结果相一致。祁生旺等[19]1994年分别对10头妊娠和10头处于发情期的奶牛乳汁中孕酮含量检测，结果显示妊娠母牛孕酮含量明显高于发情期的奶牛且差异显著。史远刚等[20]1996年对配种后22～24 d的奶牛进行检测，结果显示对未妊娠奶牛的检出率为100%，妊娠奶牛的检出率也达到了92%。蔡志强等[21]2001年通过孕酮单克隆抗体建立的孕酮包被固相RIA分析法，对配种后21～58 d的奶牛乳汁或血液样品进行孕酮含量的测定，结果显示孕酮含量对判定妊娠和空怀奶牛的诊断率均达到了90%～95%。Haffman等研究表明，奶牛乳汁中和血液中的孕酮浓度是平行的，但乳汁中孕酮含量比血液中高，同时由于乳汁容易采集，所以大部分的研究均采用奶牛的乳汁样品进行孕酮浓度的测定。RIA法具有较高的精确度和灵敏度，应用该方法对不同阶段的奶牛进行孕酮浓度测定的相关研究很多，但由于设备昂贵、技术要求高且具有放射危害等原因，在某种程度上限制了该技术的临床推广和应用。

2.9酶联免疫吸附测定法近年来，许多研究人员利用酶标记技术对孕酮进行标记后，观察底物的颜色反应或利用紫外分光光度计、酶标仪等仪器测定孕酮浓度。1987年石放雄等[22]对101头配种20～22 d的奶牛利用固相微滴板ELISA分析法测定孕酮浓度，检测结果显示妊娠和未妊娠检出率分别为92%和97%。郭大智[23]和杨国林等[24]分别建立了可目视的ELISA吸附法测定孕酮的技术，但杨国林等对人工授精后19～23 d的126头奶牛妊娠检出率仅为79%，而郭大智对112头奶牛早孕的检出率为100%，说明该技术存在一定的不稳定性。

2.10胶体金技术测定法万华生物工程有限公司（北京）制备了以小分子半抗原为决定簇的孕酮单克隆抗体，对奶牛孕酮含量的测定技术的发展提供了一定的基础。万积成等[25]于2007年在此基础上，选用胶体金双抗夹心法，将特异性的单克隆抗体结合至孕酮的位点，利用胶体金的显色效果，判断孕酮的含量，对1 559头配种22～26 d的奶牛乳汁中的孕酮含量进行测定，并结合直检结果，证明该技术对妊娠和空怀的总检出率达到95%以上，但该研究未进行交叉验证等后期验证性试验。

3 小结

综上所述，国内外针对奶牛的早期妊娠诊断进行了许多方面的研究，有些方法仍处于研究的初级阶段，其结果的可靠性和准备性有待进一步进行验证，而有些方法因受多种因素的限制无法广泛而有效地应用于生产实践中。随着奶牛养殖业的不断发展与进步，奶牛早期妊娠诊断技术也逐步转变的快速、准确、方便和经济。

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Advance of Early Pregnancy Diagnosis Technology in Dairy Cows

Bao Kai1,Cao yu1,Liu Guanglei1*,An Pengpeng2, Sun Xianzhi1,Huang Jian1,Li Fuquan1
(1.Shanghai dairycow breeding center Co.,Ltd.,Shanghai 200436; 2.Collge of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Heilongjiang Daqing 163319)

Early pregnancy diagnosis has been a problem to be solved in dairy cow.In recent years,with the rapid development of dairy industry,early pregnancy diagnosis has been had more impacts on the development of dairy cows.A simple and efficient technique for early pregnancy diagnosis is of great significance to improve dairy cattle breeding and is the basic requirement for farm management and economic benefits.This paper summarized the clinical application of early pregnancy diagnosis in order to provide a theoretical basis for the future study of early pregnancy diagnosis.

Dairy cows;Early pregnancy diagnosis;Breeding efficiency;Economic efficiency

S857.21 < class="emphasis_bold"> 文献标识码：A

A

1672-9692(2016)08-0049-04

2016-05-20

包凯（1986-），男，硕士，临床兽医学。

刘光磊（1979-），男，高级畜牧师。