结核性胸腔积液的实验室检查进展

李微蕾综述，郑辉才审校

（海南省第三人民医院呼吸内科，三亚572000）

结核性胸腔积液的实验室检查进展

李微蕾综述，郑辉才△审校

（海南省第三人民医院呼吸内科，三亚572000）

胸腔积液/诊断；结核，胸膜；实验室技术和方法；综述

正常情况下，健康人胸膜腔的脏层胸膜与壁层胸膜之间存在一个潜在的腔隙，其中有少量（30～50 mL）润滑液起着润滑作用，其产生和吸收处于一种平衡状态。胸膜腔内出现过多液体被称为胸腔积液。在引起胸腔积液的原因中，结核性胸膜炎（tuberculous pleurity，TP）是我国渗出性胸腔积液最常见的病因，其发病机制是结核分枝杆菌直接侵犯胸膜或机体对结核杆菌的迟发性超敏反应［1］。据世界卫生组织（WHO）报道，2015年全球估计共有960万例结核病新发病例，我国有93万例，为结核病高负担国家之一，其中包括TP患者。该类患者在临床上表现为结核中毒症状，如午后潮热、盗汗、疲乏无力、体质量降低等，常以单纯胸腔积液表现而就诊，导致早期临床上难以鉴别。所以，早期快速、简便的诊断方法对明确胸腔积液性质具有重要意义。明确结核性胸腔积液（tuberculous pleural effusion，TPE）的诊断需要在胸腔积液或胸膜活检组织中找到结核分枝杆菌，但传统的诊断方法，如结核分枝杆菌涂片抗酸染色和结核分枝杆菌分离培养存在检出率低、周期长等局限性，而胸膜活检和胸腔镜检查因其有创性使其临床应用受限。故选择灵敏、特异、有效的实验室检查方法是协助诊断TPE的重要手段。本文就TPE的病原学、免疫学、生物化学和分子诊断等实验室检查方法的研究进展进行综述。

1　病原学检查

胸腔积液中找到结核分枝杆菌有助于病原诊断，是诊断TPE的“金标准”，包括结核分枝杆菌涂片染色法和结核分枝杆菌培养法。

1.1结核分枝杆菌涂片染色法涂片染色检查除了常采用的齐尔-尼尔森染色法外，还有荧光显微镜抗酸杆菌检测法，但阳性率很低，涂片染色法结核分枝杆菌检出率为0%～25%［2］。徐进等［3］应用涂片、漂浮集菌、超声萃取3种方法检测结核分枝杆菌，阳性率分别为3.04%、8.66%、16.56%，超声萃取法检出率明显高于直接涂片法和漂浮集菌法。涂片染色法简单、快速、易行，但是灵敏度低，无特异性，涂片阳性只能说明胸腔积液中含有抗酸杆菌，不能区分结核分枝杆菌与其他分枝杆菌，且无法鉴别死菌与活菌。

1.2结核分枝杆菌培养法该法常作为结核病诊断的“金标准”，且培养阳性菌株的药敏试验结果是指导TP治疗的依据，目前的培养方法主要有罗氏培养法和快速培养法［4］。胸腔积液培养阳性至少需要10～100个活菌，培养周期为2～8周，其培养阳性率仅为8.5%～38.3%［3］。因此，基于传统培养方法的改良培养方法对提高阳性率尤为重要。杜博平等［4］建立了一种TPE的培养新方法，接种TPE后，含复苏因子（Rpf）的7H11培养基Rpf培养组较改良培养基可提高结核分枝杆菌的培养阳性率（43.5%），而传统改良罗氏培养组阳性率仅为16.1%，缩短了培养时间，Rpf培养组阳性结果报告时间较改良罗氏培养组提前近20 d。而快速培养法培养条件要求高，容易受临床使用抗生素的影响，仪器和培养基价格昂贵，难以在基层医院普及。因此，无论是哪种培养方法，培养周期长均不利于临床早期快速筛查。

2　免疫学检查

2.1结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）TST是基于迟发型变态反应原理的一种皮肤试验，是从结核菌的液体培养基中提取结核蛋白注射于皮内48～72 h内，依据是否发生变态反应出现硬结，判断是否感染结核分枝杆菌，并非检出结核病。TST是一项敏感度高、特异度强的检查方法。李月翠等［5］的试验结果显示，TST的敏感度为51.3%，特异度为66.9%。TST反应阳性对诊断结核感染有重要价值，但结核菌感染存在窗口期，即结核菌感染后需4～8周变态反应才能充分建立，所以，在感染初期，结核菌素试验可为阴性。另外，老年人、严重结核患者、营养不良、免疫力低下者（如艾滋病、白血病、淋巴瘤、使用免疫抑制剂等），TST也可呈假阴性。由于许多国家和地区广泛推行卡介苗接种，TST阳性不能有效区分是结核分枝杆菌的自然感染还是卡介苗接种引起的免疫反应，只有3岁以下婴幼儿且没有接种过卡介苗者TST阳性才能提示有活动性病灶［6］。所以，在卡介苗高接种率地区，TST对检测是否感染结核分枝杆菌受到了很大限制。

2.2结核抗体检测结核抗体是机体对结核菌或菌体成分发生特异性免疫应答的产物，检测的抗体类型包括IgG、IgA、IgM，常用方法包括结明试验、酶联免疫吸附试验、免疫斑点试验、蛋白质芯片技术等［7］。结核抗体检测主要用于活动性结核感染的确诊，以弥补病原学检测灵敏度过低的问题［8］。刘倩颖等［9］使用高纯度特异度抗原脂阿拉伯甘露糖在活动性肺结核患者中检出结核抗体的阳性率为72.67%，高于涂片法和TST。也有研究表明，IgG/IgM抗体联合检测及多克隆抗卡介苗IgM抗体检测，其阳性预测值可高达96%［10-11］，而且对于单纯性TP，胸腔积液结核抗体检出阳性率高于血结核抗体的阳性率，血结核抗体阴性而胸腔积液结核抗体阳性，则强烈支持TP的诊断［12］。血清抗体检测虽然是结核特异度免疫应答指标，但是引起免疫应答的抗原性比较复杂，与其他菌属存在交叉反应，而且受年龄、抗体类型、结核病类型和卡介苗接种的影响［8］，所以应结合其他辅助诊断进一步分析。

3　生物化学检查

3.1腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）ADA广泛分布于人体胸腺、脾脏、淋巴结等组织中，尤其在淋巴细胞中含量较高，其参与人体淋巴系统核酸代谢。结核杆菌及菌体成分在感染机体的过程中被T淋巴细胞介导的巨噬细胞吞噬，分泌细胞因子和炎症介质，在炎症发展过程中，T淋巴细胞遭到破坏，释放出大量ADA［13］。1979年Piras等［14］首次报道了TPE患者ADA水平显著增高，为胸腔积液的鉴别诊断和TP的诊断提供了依据。胸腔积液中ADA水平明显增高，超过免疫功能受抑制的恶性肿瘤的浆膜积液及漏出液中的ADA［13］，所以胸腔积液中ADA水平是目前诊断与鉴别TPE的重要指标。ADA临界值的界定对胸腔积液的鉴别诊断尤其重要，以往国内常以胸腔积液ADA水平大于45 U/L作为TP的诊断标准，ADA诊断TP的敏感度为71.4%，特异度为94.0%［15］；但尉艳霞等［16］研究发现，以ADA临界值为45U/L，诊断TP的敏感度仅为44.9%，特异度为100.0%，敏感度低的原因可能是炎症早期或机体免疫功能减退（如患艾滋病等）所致；将ADA界定在28.7 U/L，灵敏度则上升至75.5%，特异度为95.2%，其特异度下降可能与患有类肺炎性胸腔积液、类风湿关节炎等有关。有研究显示，胸腔积液中ADA水平大于70 U/L，则高度提示结核；反之，如果ADA水平小于40 U/L，则基本上可以排除结核，因为对于淋巴细胞丰富的胸腔积液，如类风湿关节炎、支气管肺泡癌、间皮瘤、支原体和衣原体性肺炎、鹦鹉热、肺吸虫病、感染性单核细胞增多症、普鲁菌病、地中海热、组织胞浆菌病、球孢子菌病，以及大多数脓胸患者，其胸腔积液ADA也可增高［17］。诊断阈值下降可增加诊断的灵敏度，但同时也降低了特异度；反之，增加诊断的特异度，势必以减少灵敏度为代价。

ADA诊断的敏感度和特异度不仅取决于检测结果本身，还与多种因素相关，在临床上也要考虑以下因素，才能得到更准确的结果。（1）结核病的流行程度［18］：在结核病高流行区，ADA的诊断阈值升高，在结核病低流行区，降低ADA阈值可以保持较高的阴性预测值；（2）年龄因素：年龄与胸腔积液ADA水平呈负相关，随着年龄的增长，机体免疫功能逐渐下降，淋巴细胞增殖能力减弱，释放ADA减少，所以，高龄人群采用ADA诊断TP的灵敏度较低，漏诊的可能性大［19］。单纯胸腔积液ADA测定虽然为临床提供了很大帮助，但是疾病的诊断不能只靠单一指标，需联合多种实验室检测指标才能得出最后诊断。

3.2γ-干扰素近年来，在有关TPE细胞因子的研究中，γ-干扰素受到的关注越来越多。γ-干扰素释放试验（interferon gamma release assay，IGRA）是检测结核病的一种免疫学方法，其原理是机体感染结核杆菌后产生相应具有抗原特异性的致敏T淋巴细胞，特别是CD4+T细胞，当特异性T淋巴细胞再次接触结核杆菌特异性抗原后被激活，迅速活化增殖，分泌γ-干扰素［20］。在此原理的基础上，用结核杆菌特异性抗原如早期分泌性靶抗原6（6-kDa early secretory antigenic target，ESAT-6）和滤液培养蛋白10（10-kDa culture filtrate protein，CFP-10）在体外与患者外周全血、外周血淋巴细胞或胸腔积液淋巴细胞进行检测，后二者称为结核感染T细胞斑点试验（T cell enzyme-linked immunospot tuberculosis test，T-SPOT. TB），通过酶联免疫斑点试验可定量检测γ-干扰素释放水平（即斑点水平），判断有无结核杆菌感染［21］。

陈希等［22］的研究结果显示，T-SPOT.TB的敏感度和特异度分别为91.67%和91.11%，诊断准确率为94.62%，其检测ADA的敏感度和特异度高于血清结核抗体及胸腔积液检测结果，表明T-SPOT.TB检测外周血ADA对TP的早期诊断具有较高的应用价值。Wilkinson等［23］通过比较10例TP、8例癌性胸腔积液检测结果证实，胸腔积液中分泌γ-干扰素的单个核细胞检测比外周血具有更高的敏感度和特异度。江静等［24］指出，γ-干扰素测定诊断TP的总灵敏度（89%）和总特异度（97%）均较高，测定胸腔积液中γ-干扰素含量有助于诊断TP。石慧等［25］取外周血及胸腔积液同时行T-SPOT.TB检测，结果表明，外周血诊断TP的敏感度为88.9%，特异度为83.3%，而胸腔积液诊断TP的敏感度更高，达100.0%，这可能与TP患者胸膜腔内局部免疫增强，效应T细胞向胸腔积液转移有关；该研究还对TP组患者进行了3个月的规律抗结核治疗，随诊后再次行外周血T-SPOT.TB检测，发现其斑点形成细胞数出现下降趋势，说明外周血T-SPOT.TB检测可用于评估疗效及监测病情活动，即如果斑点数在短时间内显著增加，则提示体内结核活动［26］，可为临床抗结核治疗效果评估提供依据。

大部分研究对入组对象的选择会排除免疫低下（如患艾滋病、使用免疫抑制剂等）、营养不良等因素，以减少对检测结果的影响，但往往这些免疫低下、营养不良的患者更容易合并结核病。张丽帆等［26］通过对国外多项数据的研究表明，年龄、人类免疫缺陷病毒感染状态和营养不良对T-SPOT.TB结果无影响，但在婴幼儿的研究结果中，T-SPOT.TB的敏感度仅为50%，说明婴幼儿运用T-SPOT.TB诊断结核的敏感度会降低。T-SPOT. TB主要针对ESAT-6和CFP-10进行检测。郑春华等［27］报道，1996年Mahairas将在结核杆菌上发现的一段基因序列命名为“RD1”，ESTA-6和CFP-10均来自RD1区，而且只有结核分枝杆菌存在RD1区，所有卡介苗和大多数环境分枝杆菌都缺失该区域［21］。所以，T-SPOT.TB不受卡介苗及其他致病性非结核分枝杆菌的干扰，在我国卡介苗高接种地区检测意义较大。

结核感染可以分为潜伏性结核和活动性结核，机体免疫力低下时，结核杆菌大量复制增殖，从而导致结核活动。目前还没有直接诊断潜伏性结核的方法，主要依靠TST和γ-干扰素释放试验来协助诊断，国内也缺乏对潜伏性结核发病的大规模前瞻性研究。阮巧玲等［28］通过6年的前瞻性随访研究指出，活动性肺结核患者的家庭接触者进展为活动性结核的年发病率为1.1%（11/ 1 000），即每年每1 000个家庭接触者中有11人发病，与中国一般人群中结核病年发病率73/10万相比，家庭接触者发展为活动性结核病的风险显著升高，表明T-SPOT.TB与TST预测活动性结核病的能力相仿，TSPOT.TB检测与活动性结核病的发生关联程度弱。王睿等［29］基于国外的多项临床研究报告提出，IGRA和TST在诊断潜伏性结核感染的应用价值大致相当，与阮巧玲等［28］研究结论一致，但在IGRA诊断活动性肺结核、肺外结核及IGRA评价抗结核治疗效果3个方面提出疑问，与国内研究结果不同的是，该报告指出T-SPOT.TB对于诊断活动性肺结核的价值不大，IGRA对诊断TP没有应用价值，在评价抗结核治疗方面的作用有限。作者认为，有关IGRA的论文大部分是发达国家的临床研究报告，与我国的结核高负担现状存在差异，需进行大规模前瞻性研究进一步评价IGRA在我国的应用价值［29］。3.3C反应蛋白（C-reactionprotein，CRP）CRP是一种环状五球体蛋白，广泛分布于胸腔积液、腹水、心包积液和血液中，感染时CRP水平会显著升高，反映机体急性炎症状态，不受年龄、性别、血红蛋白水平等因素的影响，是TP的一项辅助诊断指标。唐军［30］对60例TPE和60例癌性胸腔积液的检测结果显示，结核组患者胸腔积液中CRP为（13.6±3.1）mg/L，肿瘤组为（8.6±2.2）mg/L，结核组CRP阳性率为91.67%，肿瘤组为6.67%，提示以CRP水平大于11 mg/L为诊断标准，CRP诊断TPE的特异度为91.67%。但由于CRP为广泛存在的急性时相反应蛋白，需排除其他可能感染后才能进行鉴别诊断。

3.4其他生化指标TPE中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）、IL-2及sIL-2R、IL-6、IL-27、CA125、D-二聚体等生化指标均可升高。有研究显示，多项指标联合检测能提高诊断TP的灵敏度。但是所有的生化指标都缺乏特异度，需要多种指标联合检测，并结合临床和其他检查才能确诊。

4　分子诊断

WHO推荐了2种分子生物学技术，即DNA探针和实时荧光定量PCR。

4.1DNA探针DNA探针技术是用结核分枝杆菌DNA片段直接在硝酸纤维膜上点样，包括全染色体DNA探针、克隆DNA片段和寡核苷酸探针等，与固定在硝酸纤维膜上的DNA进行杂交，同时用放射性或生物素标记，经显色后观察结果。但因其灵敏度不够高，需联合DNA指纹、DNA测序等其他技术，操作复杂，在临床上难以开展。

4.2实时荧光定量PCRPCR是选用一对特定的寡核苷酸引物介导的结核菌某特定核酸序列的DNA体外扩增技术，现有巢式PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR等。自2010年底开始，WHO推荐将结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（Xpert my cobacterium tuberculosis/rifampicin，Xpert MTB/RIF）作为结核病及利福平耐药结核病的主要诊断工具，Xpert MTB/RIF以半巢式及实时荧光定量PCR为技术基础，不但可以诊断结核病，还可进行菌种复合群检测及耐药检测。贾留群等［31］采用Xpert MTB/RIF对肺外结核的诊断价值进行了meta分析，结果显示，Xpert MTB/RIF对TPE的敏感度为0.32（95%CI 0.20～0.47），特异度为1.00（95%CI 0.91～1.00）。可以看出，Xpert MTB/RIF对诊断TPE的敏感度欠佳，但是具有较高的特异度，对诊断TPE有一定价值。

5　小结与展望

要达到全球终止结核病的目标，需要在诊断方法上采取特异度与敏感度更高且更安全、更方便的诊断技术及有效的治疗手段，但由于基层医院条件、能力、资源等因素制约，阻碍了先进检测方法的开展。单一的实验室检测方法敏感度不一致，如结核菌涂片检查的检出率为0.0%～25.0%，胸腔积液培养阳性率为8.5%～38.3%，TST的敏感度为51.3%，ADA检测敏感度为71.4%，IGRA敏感度可达88.9%，但由于各项检测指标受多种因素的影响，特异度不一，所以会导致误诊、漏诊的发生，因此，多种实验室指标联合检测对TP的诊断准确性较高［32］。2015年全球结核病报告指出，一种新的诊断平台Gene Xpert Omni®正在开发，预计比现有的分子诊断技术将更小巧、轻便和便宜，为基层医院获得准确、快速的诊断带来福音。

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（2016-05-12）