血液病毒核酸检测技术在我国的应用现状

徐传国

(天津市滨海新区塘沽中心血站，天津 300456)



·综 述·

血液病毒核酸检测技术在我国的应用现状

徐传国

(天津市滨海新区塘沽中心血站，天津 300456)

核酸检测技术(NAT)是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称，是一种灵敏度、特异性高和检测通量大的血液病毒检测方法，可明显缩短血液病毒检测窗口期并能检测出因病毒变异而漏检的血液，显著提高输血安全。本文对血液病毒核酸检测技术在我国的应用现状进行综述，以期为我国血站开展血液病毒核酸检测在方法选择、检测系统选择、实验室的建设和管理、检测模式等方面提供参考。

血液病毒；核酸检测技术(NAT)；应用现状

输血安全最大的威胁是输血传播疾病的发生。常规检测方法(酶联免疫)存在窗口期过长和病毒变异等现象[1]，有较大漏检的风险，给输血安全带来巨大威胁。近些年在天津、甘肃、成都、杭州等血液中心陆续出现5例人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus， HIV)阳性窗口期漏检情况。核酸检测技术(nucleic acid detection technology， NAT)在国内临床中的应用已有近20年，积累了丰富的实验室和质控管理经验，同时近些年来政府对采供血机构的支持投入不断加大，血站系统软硬件设施均有明显提升，使得在国内血站推广应用血筛NAT检测成为可行方法。当前输供血形势比较严峻，采用灵敏度高、窗口期短的血液NAT检测技术迫在眉睫。现对血液核酸检测技术在我国的应用现状综述如下。

1 NAT应用概况

NAT主要原理是将病毒核酸直接扩增或其附带的信号放大后，转变成直观的光电或可视信号，继而判断相应的病原体是否存在于标本中，检测步骤包括核酸的提取、扩增和检测。方法主要有PCR扩增和转录介导的TMA扩增。PCR是在体外模拟自然DNA半保留复制过程的NAT技术，具有灵敏度和特异性高等特点；TaqDNA聚合酶(TaqDNA polymerase)的使用实现了PCR技术自动化检测。TMA可以DNA或RNA为模板，在约42 ℃等温反应条件下利用RNA聚合酶和逆转录酶进行扩增，产物为RNA。TMA操作简便，扩增效率高，适于高通量检测[2-4]。1997年荷兰和德国最早将NAT应用于血液筛查，日本是全世界首个将核酸检测应用于常规血液筛查的国家，1999年新加坡、美国等国也陆续开展，英法两国则从2000年开始进行NAT检测[5]。在中国，2000年初厦门、山东、上海、深圳等地相继开展了血液病毒核酸检测，取得了一定的成效；2010年和2012年在多家血液中心(血站)开展了血液核酸检测试点工作，在核酸检测实验室建设和质量管理、人员培训、血液筛查模式等方面积累了丰富的经验，显著降低了输血传播疾病的风险，为在全国范围开展血液病毒核酸检测奠定了良好的基础。

2 我国应用的NAT检测系统

目前已经国家药监局(SFDA)批准、可应用于血液病毒NAT检测的系统有下列几种[5]。

2.1 美国诺华公司的Tigris检测系统 Tigris检测设备配套Procleix Ultrio Assay检测试剂，能够检测HBV、HCV、HIV-1，采用TMA化学发光技术，为单人份样本检测模式，能够鉴别出病毒种类。Tigris是集标本加样、核酸提取、扩增、检测于一体的全自动检测系统，扩增效率高，操作简便，适于高通量检测。

2.2 美国罗氏公司的s201检测系统 由加样、提取、扩增检测设备配套cobas TaqScreen MPX检测试剂，采用荧光PCR扩增技术，为6人份的样本混合检测模式，如有反应性需进一步进行单人份拆分检测，能够检测HBV、HCV、HIV-(1+2)，并能区分出病毒种类。

2.3 中山达安、上海科华、上海浩源血源筛查系统 3家均为国内公司，都研发生产出了国产NAT检测试剂盒，能够检测HBV、HCV、HIV-1，配套检测设备均为进口设备，在自动混样仪上进行混样、加样、核酸提取，使用荧光PCR仪进行核酸扩增检测，3家采用的均是荧光定量PCR法，为8人份的样本混合检测模式，如有反应性需进一步进行单人份拆分检测，能区分出病毒种类。

可见目前国内血站核酸检测模式主要有3个：单检、6混样、8混样。在进行血液NAT检测时，NAT对每份样本检测的灵敏度至关重要，样本数不能混合过多，样本数混合越少检出率越高，检测单人份样本最为理想，不然低病毒含量的血液易被漏检。此外各检测系统检测原理和试剂检测的灵敏度也不尽相同，对每种病毒的检出能力也有所不同，各血站须依据本地区的流行病学特点以及国内外试剂的检测性能、各种检测模式对病毒的检出能力等并结合成本-效益分析，选择适用于本地区的血液核酸检测系统。

3 血液病毒核酸检测的规范化管理

我国血站技术操作规程(2015版)从多方面对血液病毒核酸检测进行了规范性要求，有效地保证了血液病毒核酸检测质量。

3.1 NAT检测试剂、仪器设备和信息系统的管理要求 必须选择经SFDA批准的血源筛查试剂，实验室应建立试剂的评价选择和确认、证照审核程序，建立并执行进货查验制度、质检制度，将说明书列入文件受控范围，做好试剂的储存和质量监控。新的或经过维修后对检测结果可能造成影响的设备在投入使用前须经过确认，系统在投入使用前须进行分析灵敏度验证，依据设备说明书进行操作。对整个检测过程须使用实验室信息管理系统进行管理，应设置系统运行参数的权限控制。

3.2 NAT实验室防污染控制 实验室应设置试剂耗材储存区、标本制备区、扩增检测区，各区不允许直接相通。对空气流向实施控制，扩增产物不得进入扩增前的区域。实验室须配有清洁、消毒设施，在试验完成后进行清洁和消毒。

3.3 NAT检测标本和试验操作的管理 标本的质量、可追溯性应符合要求。制定标本采集与送检程序，使用无菌、无DNA和RNA酶含惰性分离胶的真空采血管。依据试剂生产商提供的试剂使用说明书进行操作，设置自动化设备运行参数的权限控制。

3.4 试验性能监控和试验结果的判定 须对检测过程的试验性能进行持续监控，使用质控品的测定数据进行室内质控，监控检测系统的有效性和稳定性。须参加实验室室间质量评价活动，以评价实验室核酸检测的能力。对每批试验关键控制点进行核查，制定试验有效性和标本试验结果的判定规则。

4 血液NAT检测在我国的应用效果

采用对ELISA检测HBsAg、抗-HCV、HIV抗原抗体结果阴性的献血者血液进行NAT混样检测模式，其阳性检出率西安为0.07%[6]、厦门为0.13%[7]、上海为0.1%[8]、常州为0.1%[9]。采用对献血者平行进行ELISA和NAT单检检测模式，其阳性检出率南京为0.06%[10]、青岛为0.1%[11]。阳性检出率的不同可能与区域人群分布差异以及HBV感染率的差异有关(NAT阳性中HBV占绝大多数)。国内亦有地区NAT检测出HIV、HCV的报道[7]。可见，对献血者血液进行NAT检测可以及时检出“窗口期”血液，有效降低输血传播HBV、HCV 和HIV的风险。由于ELISA 检测方法对部分“窗口期”标本存在较多的漏检，以及NAT方法对“窗口期”、隐匿性感染标本在检测方面的优势，在ELISA检测HBV、HCV 和HIV方法的基础之上，联合对献血者的血标本进行NAT检测，能进一步防止“窗口期”、隐匿性感染血液进入输血流程，从而减少HBV、HCV 和HIV 通过输血传播的可能性，进一步提高输血安全。

5 结束语

我国已将NAT血液筛查纳入《全血及成分血质量要求》[12]中，并且国家卫生计生委下发了《关于做好血站核酸检测工作的通知》，要求各地确保2015年全部开展血液病毒核酸检测。目前不论从技术、人员资质以及质量管理水平等方面，我国均具备了全面开展血液病毒核酸检测的条件，而主要的制约因素为检测经费的落实。相信随着我国经济水平的不断提升，逐步摸索建立适合我国国情的血液病毒筛查模式，既能减少经济的投入，又能最大限度地降低输血残余风险，从而保证输血安全。

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R446.11

A

10.11851/j.issn.1673-1557.2016.06.001

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20161109.1559.014.html

2016-03-23)

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