klotho在慢性肾脏病分期及其并发继发性甲状旁腺功能亢进症中的作用

林书典，詹 锋，武 伟，潘楚瑛，张 延，刘 颖，詹宇威

·论著·

klotho在慢性肾脏病分期及其并发继发性甲状旁腺功能亢进症中的作用

林书典，詹 锋，武 伟，潘楚瑛，张 延，刘 颖，詹宇威

【摘要】目的初步探讨klotho在慢性肾脏病(CKD)分期及其并发继发性甲状旁腺功能亢进症(SHPT)中的作用。方法选取2012—2014年在海南省人民医院肾病风湿科门诊或住院的符合纳入与排除标准的CKD患者85例为研究对象。根据CKD分期标准，将患者分为CKD1～2组(26例)、CKD3～4组(34例)和CKD5组(25例)。CKD 3～5期的患者根据甲状旁腺素(PTH)水平分为非SHPT组(n-SHPT组，PTH≤120 ng/L，26例)和SHPT组(PTH>120 ng/L，33例)。收集患者的基本资料(性别、年龄、体质量、血压)，检测其常规血清学指标〔血红蛋白(Hb)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、清蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)及血肌酐(Scr)、钙、磷、碱性磷酸酶(ALP)、肾小球滤过率(GFR)、PTH〕和可溶型klotho(s-kl)、25-羟基维生素D(25-OH-D)、成纤维细胞生长因子23(FGF-23)水平。结果CKD3～4组、CKD5组平均动脉压(MAP)、Hb、BUN、Scr、钙、磷、ALP、PTH与CKD1～2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；CKD5组ALT与CKD1～2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；CKD5组Hb、ALT、AST、BUN、Scr、钙、磷、ALP、PTH与CKD3～4组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。CKD3～4组、CKD5组s-kl、25-OH-D、FGF-23水平与CKD1～2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；CKD5组s-kl、25-OH-D、FGF-23水平与CKD3～4组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。n-SHPT组、SHPT组ALB、BUN、Scr、钙、磷、ALP、GFR、s-kl、25-OH-D水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。s-kl与钙、GFR、25-OH-D呈正相关，与磷、ALP、PTH呈负相关(P<0.05)；s-kl与FGF-23无直线相关关系(P>0.05)。PTH水平影响因素的直线回归分析结果显示，钙进入回归方程，回归方程为y=334.20-92.02x(P<0.05)。结论klotho水平随着CKD进展逐渐下降，其在CKD及其合并SHPT患者中降低可能是促进CKD进展和钙代谢失调，进而导致SHPT发生并加重的原因之一。

继发性甲状旁腺功能亢进症(secondary hyperparathyroidism，SHPT)是慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)常见并发症，也是影响终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)患者预后的重要因素。目前已经证实，甲状旁腺是klotho基因表达的重要器官之一[1]。研究发现，CKD患者体内钙磷失衡、维生素D缺乏、骨质疏松以及继之而来的SHPT均与klotho表达水平降低和成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factors-23，FGF-23)表达水平升高密切相关，但迄今为止，klotho表达水平在CKD并发SHPT患者体内的变化仍存在争议，其作用机制有待阐明[2]。为此，本研究通过观察并比较CKD患者血清中可溶型klotho(soluble klotho，s-kl)、FGF-23、甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)水平，初步明确klotho在CKD分期及其并发SHPT中的作用机制，以期进一步阐明klotho在CKD并发SHPT疾病进程中的临床意义及理论基础。

1对象与方法

1.1纳入与排除标准纳入标准：(1)符合肾脏病预后质量指南-慢性肾脏病(K/DOQI-CKD)诊断标准[3]；(2)年龄≥18岁；(3)入选前2周内未使用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)和影响钙磷代谢及PTH分泌的药物；(4)心肺功能稳定及肝功能正常者。排除标准：(1)有透析(腹膜透析或血液透析)史、肿瘤、原发性或继发性骨骼疾病病史、原发性甲状旁腺功能亢进症或甲状旁腺手术史；(2)1个月内患有感染性疾病史；(3)半年内服用泼尼松或其他激素超过30 d；(4)1年内使用过双磷酸盐或降钙素者[4]。

1.2研究对象及分组选取2012—2014年在海南省人民医院肾病风湿科门诊或住院的符合纳入与排除标准的CKD患者85例为研究对象。其中男48例，女37例；年龄18～71岁，平均年龄(37.1±13.3)岁。分组：(1)根据CKD分期标准〔按照肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)水平划分〕[3]分为CKD1～2组(26例)、CKD3～4组(34例)和CKD5组(25例)。(2)CKD 3～5期的患者根据PTH水平[4]分为非SHPT组(n-SHPT组，PTH≤120 ng/L，26例)和SHPT组(PTH>120 ng/L，33例)。本研究获得海南省人民医院医学伦理委员会批准，研究对象均知情同意。

1.3研究方法

1.3.1基本资料收集收集患者的基本资料，包括性别、年龄、体质量、血压。

1.3.2常规血清学指标检测清晨空腹采集静脉血(2×10 ml)，提取血清置-80 ℃冰箱中保存备检。采用全自动血液细胞学分析仪检测血红蛋白(Hb)水平，全自动生化分析仪检测肝肾功能〔包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、清蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)〕、电解质(包括钙、磷)、碱性磷酸酶(ALP)水平，核素肾动态显像(99Tcm-DTPA)检测GFR水平，电化学发光法(罗氏公司诊断试剂盒)测定PTH水平。

1.3.3s-kl、25-羟基维生素D(25-hydroxyvitamin D，25-OH-D)、FGF-23水平检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中s-kl、25-OH-D、FGF-23水平，按照产品试剂盒说明书操作。

2结果

2.1CKD1～2组、CKD3～4组和CKD5组患者基本资料及常规血清学指标比较CKD1～2组、CKD3～4组、CKD5组性别、年龄、体质量、ALB水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。CKD1～2组、CKD3～4组、CKD5组MAP、Hb、ALT、AST、BUN、Scr、钙、磷、ALP、PTH水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。CKD3～4组、CKD5组MAP、Hb、BUN、Scr、钙、磷、ALP、PTH水平与CKD1～2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；CKD5组ALT水平与CKD1～2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；CKD5组Hb、ALT、AST、BUN、Scr、钙、磷、ALP、PTH水平与CKD3～4组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2CKD1～2组、CKD3～4组和CKD5组患者s-kl、25-OH-D、FGF-23水平比较CKD1～2组、CKD3～4组、CKD5组s-kl、25-OH-D、FGF-23水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。CKD3～4组、CKD5组s-kl、25-OH-D、FGF-23水平与CKD1～2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；CKD5组s-kl、25-OH-D、FGF-23水平与CKD3～4组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3n-SHPT组和SHPT组患者各项指标比较n-SHPT组与SHPT组性别、年龄、体质量、MAP、Hb、ALT、AST、FGF-23水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。n-SHPT组与SHPT组ALB、BUN、Scr、钙、磷、ALP、GFR、s-kl、25-OH-D水平比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

2.4相关性分析s-kl与钙、GFR、25-OH-D呈正相关，与磷、ALP、PTH呈负相关(P<0.05)；s-kl与FGF-23无直线相关关系(P>0.05，见表4)。

Table 2Comparison of s-kl,25-OH-D and FGF-23 levels among CKD1-2,CKD3-4 and CKD5groups

组别例数s-kl(ng/L)25-OH-D(nmol/L)FGF-23(ng/L)CKD1～2组26710±145 86±16 99±17 CKD3～4组34513±132a63±16a117±28aCKD5组25394±90ab52±12ab143±49abF值41.60836.36414.291P值<0.001<0.001<0.001

注：与CKD1～2组比较，aP<0.05；与CKD3～4组比较，bP<0.05；s-kl=可溶型klotho，25-OH-D=25-羟基维生素D，FGF-23=成纤维细胞生长因子23

表4　s-kl与各指标的相关性分析

表1　CKD1～2组、CKD3～4组和CKD5组患者基本资料及常规血清学指标比较

注：a为χ2值；与CKD1～2组比较，bP<0.05；与CKD3～4组比较，cP<0.05；1 mm Hg=0.133 kPa;CKD=慢性肾脏病，MAP=平均动脉压，Hb=血红蛋白，ALT=丙氨酸氨基转移酶，AST=天冬氨酸氨基转移酶，ALB=清蛋白，BUN=尿素氮，Scr=血肌酐，ALP=碱性磷酸酶，PTH=甲状旁腺素

表3　n-SHPT组和SHPT组患者各项指标比较

注：a为χ2值；SHPT=继发性甲状旁腺功能亢进症

2.5PTH水平影响因素的直线回归分析以PTH为因变量(连续性变量)，以BUN、Scr、钙、磷、ALP、GFR、s-kl、25-OH-D、FGF-23为自变量(连续性变量)，进行直线回归分析，结果显示，钙进入回归方程，回归方程为y=334.20-92.02x(P<0.05)。

3讨论

klotho是一种影响CKD发生发展的重要跨膜蛋白，除了在大脑脉络膜和肾脏中高表达外，甲状旁腺也是其表达的重要器官之一。klotho表达水平升高可以减少尿蛋白排出，延缓肾功能下降，调节钙磷失衡，是目前研究延缓CKD进展的热点之一[5]。klotho以2种形式存在，即膜结合型klotho(membrane klotho，m-kl)和s-kl，s-kl以酶切裂解的方式从细胞膜表面与m-kl分离，直接释放至血循环中[6]。研究发现，m-kl可与FGF受体(FGF receptors，FGFRs)结合形成klotho-FGFRs复合物，然后与FGF-23结合，而s-kl可极大增强FGF-23与klotho-FGFRs复合物的亲和力；通过检测血液中s-kl水平，可间接反映细胞膜上klotho表达水平[6]。

调节钙磷平衡和维生素D代谢是klotho的重要功能之一，研究发现，klotho联合FGF-23在肾脏近端小管上皮细胞与FGFRs结合形成FGF-23/klotho-FGFRs复合物，抑制磷的重吸收，远端小管上皮细胞通过稳定瞬时受体电位V5-钙(TRPV5-Ca2+)通道调节钙的重吸收，并抑制肾脏1-α-25羟化酶(1-alpha-25 hydroxylase)活性，下调骨化三醇水平[7]。在正常生理状态下，klotho与PTH对钙磷转运具有协同作用，但对骨化三醇的合成作用却截然相反。然而，ESRD时FGF-23/klotho-FGFRs复合物和PTH对无机磷的重吸收调控作用失效，持续增高的PTH引起骨骼过度释放无机磷至血循环中，导致高磷血症加重[8]。本研究结果显示，CKD3～4组和CKD5组钙、s-kl、25-OH-D水平低于CKD1～2组，CKD5组钙、s-kl、25-OH-D水平低于CKD3～4组，CKD3～4组和CKD5组磷、PTH、FGF-23水平高于CKD1～2组，CKD5组磷、PTH、FGF-23水平高于CKD3～4组，提示随着GFR的降低，肾功能的进展恶化，s-kl水平逐渐降低，CKD患者肾脏klotho表达水平减少，klotho-FGFRs复合物水平下降，不能充分结合FGF-23使其失去生物学效应；磷排泄减少并潴留，钙重吸收发生障碍，高磷、低25-OH-D又进一步加重低钙，低钙和高FGF-23持续刺激甲状旁腺分泌PTH，最终导致SHPT，而高水平的PTH刺激骨骼释放无机磷入血，再加重高磷血症，由此形成恶性循环。本研究结果显示，SHPT组钙、s-kl、25-OH-D水平低于n-SHPT组，ALP水平高于n-SHPT组，从另一方面也提示了这一可能机制。

本研究结果显示，s-kl与钙、GFR、25-OH-D呈正相关，与磷、ALP、PTH呈负相关，提示klotho可能在SHPT和肾性骨病中发挥重要作用[9]，其确切机制有待更深入的研究。另一方面，BUN、Scr、磷、ALP、GFR、s-kl、25-OH-D、FGF-23与PTH均无线性回归关系。目前已证实，甲状旁腺是FGF-23作用的靶器官之一，可同时表达klotho和FGFRs，虽然klotho和 FGFRs均不能单独与FGF-23结合[10]，但s-kl可极大增强FGF-23与klotho-FGFRs复合物的亲和力，其作为辅助因子参与FGF-23抑制PTH的分泌作用，使之维持在正常水平[6]。研究发现，CKD时骨组织分泌FGF-23增多，但甲状旁腺细胞中klotho、FGFRs表达水平下降，导致FGF-23不能有效对甲状旁腺分泌PTH进行有效调节，PTH持续分泌增多，SHPT逐渐加重。同时，CKD并发SHPT时甲状旁腺组织增生，自主分泌PTH[11-13]。提示CKD时PTH可能不受FGF-23/klotho-FGFRs复合物调节，另外甲状旁腺组织增生自主分泌PTH可能也是导致SHPT的重要原因，甚至是否仅依赖于FGF-23/klotho-FGFRs复合物途径调节，仍有待更深入的研究。

本研究仅初步观察CKD患者及CKD并发SHPT患者中s-kl、FGF-23水平的变化，限于样本量较少，入选病种的多样化，加之临床患者病情及治疗方案的异同等因素，研究结果不能确切阐明klotho和FGF-23在SHPT中的发病机制，仅可提示FGF-23/klotho-FGFRs复合物调节通路可能对CKD及其并发SHPT的发生发展产生影响。

综上所述，klotho表达水平随着CKD进展逐渐下降，其在CKD及其合并SHPT患者中降低可能是促进CKD进展和钙代谢失调，进而导致SHPT发生并加重的原因之一，为进一步的深入研究提供了思路。

作者贡献：林书典进行实验设计与实施、资料汇总整理、撰写论文、成文并对文章负责；詹锋对实验设计与实施进行指导，对实验结果进行质控校对，指导论文写作及审校；武伟、潘楚瑛、张延进行病例资料收集、整理；刘颖、詹宇威负责实验操作。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔丽红)

【关键词】肾病；甲状旁腺功能亢进症,继发性；klotho；成纤维细胞生长因子23

林书典，詹锋，武伟，等.klotho在慢性肾脏病分期及其并发继发性甲状旁腺功能亢进症中的作用[J].中国全科医学，2016，19(3)：272-276.[www.chinagp.net]

Lin SD,Zhan F,Wu W,et al.Effect of klotho on chronic kidney disease staging and secondary hyperparathyroidism[J].Chinese General Practice，2016，19(3)：272-276.

Effect of klotho on Chronic Kidney Disease Staging and Secondary HyperparathyroidismLINShu-dian,ZHANFeng,WUWei,etal.DepartmentofNephrology&Rheumatology,HainanGeneralHospital,Haikou570311,China

【Abstract】ObjectiveTo make a preliminary investigation on the effect of klotho on chronic kidney disease (CKD) staging and secondary hyperparathyroidism (SHPT).MethodsFrom 2012 to 2014,85 CKD inpatients and outpatients who accorded with the inclusion and exclusion criteria from the Department of Nephrology & Rheumatology of Hainan General Hospital were enrolled in the study.According to CKD staging criteria,divided the patients into three groups:CKD1-2 group (n=26),CKD3-4 group (n=34) and CKD5 group (n=25).The patients at CKD 3-5 stages were divided into n-SHPT group (PTH≤120 ng/L;n=26) and SHPT group (PTH>120 ng/L;n=33).The basic data (gender,age,body weight and blood pressure) of the patients were collected,and the serum levels of hemoglobin (Hb),alanine aminotransferase (ALT),glutamate aminotransferase (AST),albumin (ALB),urea nitrogen (BUN),serum creatinine (Scr),calcium,phosphorus,alkaline phosphatase (ALP),glomerular filtration rate (GFR),parathyroid hormone (PTH),soluble klotho (s-kl),25- hydroxy vitamin D (25-OH-D),and fibroblast growth factor 23 (FGF-23) were detected.ResultsCKD3-4 group and CKD5 were significantly different from CKD1-2 group in MAP,Hb,BUN,Scr,calcium,phosphorus,ALP and PTH (P<0.05);CKD5 group was significantly different from CKD1-2 in ALT(P<0.05);CKD5 group was significantly different from CKD3-4 in Hb,ALT,AST,BUN,Scr,calcium,phosphorus,ALP and PTH (P<0.05).CKD3-4 group and CKD5 group were significantly different from CKD1-2 group in the levels of s-kl,25-OH-D and FGF-23(P<0.05);CKD5 group and CKD3-4 group were significantly different in the levels of s-kl,25-OH-D and FGF-23(P<0.05).n-SHPT group and SHPT group were significantly different in the levels of ALB,BUN,Scr,calcium,phosphorus,ALP,GFR,s-kl and 25-OH-D (P<0.05).s-kl was positively correlated with calcium,GFR and 25-OH-D,and was negatively correlated with phosphorus,ALP and PTH(P<0.05);s-kl and FGF-23 had no linear correlation between each other (P>0.05).Linear regression analysis of the influencing factors for PTH level showed that calcium entered the regression equation,and the regression equation was y=334.20-92.02x(P<0.05).Conclusionklotho level decreases with CKD progressing,and its decrease in CKD patients complicated with SHPT may be one of the reasons for CKD development and metabolic disorder of calcium,which further induces SHPT.

【Key words】Nephrosis;Hyperparathyroidism,secondary;klotho;Fibroblast growth factor 23

(收稿日期：2015-06-26；修回日期：2015-09-29)

【中图分类号】R 582.1

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.006

通信作者：林书典，570311 海南省海口市，海南省人民医院肾病风湿科；E-mail：linsd0110@163.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81360118)；海南省自然科学基金资助项目(309087)
作者单位：570311 海南省海口市，海南省人民医院肾病风湿科