狼毒大戟石油醚提取物对小鼠肝脏细胞凋亡及p-ERK、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶-3的影响

蔡珍珍　金　铭　杨盼盼　刘吉成

(齐齐哈尔医学院精神卫生学院，黑龙江　齐齐哈尔　161006)



狼毒大戟石油醚提取物对小鼠肝脏细胞凋亡及p-ERK、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶-3的影响

蔡珍珍金铭1杨盼盼刘吉成1

(齐齐哈尔医学院精神卫生学院，黑龙江齐齐哈尔161006)

摘要〔〕目的探讨狼毒大戟石油醚提取物对小鼠肝脏细胞凋亡及磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、Bcl-2、Bax、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3表达的影响。方法80只昆明种小白鼠随机分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和植物油对照组，每组20只。采用腹腔注射法给药，1次/d(0.39、0.78、1.55 mg·kg-1·d-1)。于实验第14天分别进行体重测量，对小鼠肝脏组织进行HE染色，TUNEL法原位标记凋亡细胞，采用免疫组织化学染色检测Bcl-2、Bax蛋白表达，Western印迹法检测p-ERK、Caspase-3蛋白表达。实时定量PCR对Bcl-2、Bax、Caspase-3进行定量分析。结果与植物油对照组比较，高剂量组小鼠体重明显下降，肝脏细胞发生明显凋亡，p-ERK、Bcl-2表达下调，Bax表达上调(P<0.05)，Caspase-3产生活化形式的Cleaved-Caspase-3。结论狼毒大戟石油醚提取物可使小鼠肝脏细胞发生凋亡，其机制可能与降低p-ERK、Bcl-2，增强Bax蛋白表达，并使Caspase-3产生活化形式的Cleaved-Caspase-3有关。

关键词〔〕狼毒大戟；凋亡；Bcl-2

1齐齐哈尔医学院医药科学研究院多基因病研究所

第一作者：蔡珍珍(1982-)，女，硕士，助理研究员，主要从事抗肿瘤、抗抑郁药物研究。

狼毒大戟是大戟科植物，文献报道称，狼毒大戟可用于治疗肝癌、肺癌、胃癌等恶性肿瘤，对结核杆菌也有较好的抑制作用〔1〕，临床疗效显著，并未发现对心、肝、肾等系统的不良反应。本实验使用狼毒大戟石油醚提取物，对昆明种小鼠进行体内试验，发现其对小鼠肝脏具有一定的毒性。

1材料与方法

1.1动物、药品、试剂及仪器近郊系昆明种小白鼠，雄性，清洁级，体重(20±2)g，由吉林大学实验动物中心提供。狼毒大戟石油醚提取物，由齐齐哈尔医学院药物研究所提供，使用植物油将药物配制成所需浓度，过滤备用。免疫组化染色：一抗(康为生物有限公司，兔抗小鼠Bax单克隆抗体，兔抗小鼠Bcl-2单克隆抗体)免疫组化SP试剂盒、DAB显色剂、PBS缓冲液(购于康为生物有限公司)。逆转录试剂盒SYBR® ExScriptTM RT-PCR Kit(Pefect Real Time)、PCR试剂盒RNAiso Reagent(购于宝生物工程有限公司)。Western印迹：一抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，兔单克隆抗体ERK、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3。PCR System 扩增仪2700(Applied Biosystems公司)，荧光定量PCR仪ABI 7300(ABI 公司)。光学显微镜CX31R BSF(Olympus)，图像分析系统 DP801(Alphamiager公司)，DK-8D型电热恒温水浴箱(上海合恒仪器设备有限公司)，METTLER TOLEDO PH测试仪(上海秋腾贸易有限公司)，79-1磁力加热搅拌器(上海雷磁新泾仪器有限公司)，THZ-82型恒温振荡器(江苏太仓医疗器械厂)，AL204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，HL-2000电子杂交箱〔香港兴万电子仪器(厦门)有限公司〕，SF-300型手压式封口机(海旗荣实业有限公司)，24DN制胶器(北京市六一仪器厂)，TS-100脱色摇床(南京庚辰科学仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组近郊系昆明种小白鼠80只，实验开始前进行适应性喂养，保持环境安静，温度保持在18～20℃，自然光线，实验小鼠未发现有孕，状态良好。随机分为四组：植物油对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组20只。

1.2.2给药参照文献〔2〕LD50测定值，给予腹腔注射，低、中、高剂量组给药量分别为0.39、0.78、1.55 mg·kg-1·d-1，植物油对照组给予等体积植物油。连续注射14 d，不禁食水，末次给药后禁食16～20 h，断颈处死小鼠，取肝脏组织置于冰生理盐水中充分洗涤，滤纸吸干，称取肝组织备用。

1.2.3TUNEL法检测小鼠肝脏组织凋亡石蜡包埋的肝脏组织，采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法检测。根据凋亡阳性细胞分布情况，每张切片取10个阳性视野，每个视野以30个细胞中阳性细胞数来计数，平均阳性细胞所占百分比，即细胞凋亡率(AR)。

1.2.4免疫组织化学法检测Bcl-2、Bax取石蜡包埋的肝脏组织，相应部位连续切片各5张，采用过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)法进行免疫组织化学染色，并DAB显色，通过苏木素复染、水洗、盐酸乙醇分化后返蓝，常规脱水、透明、中性树胶封片。每一张切片在阳性表达区域挑选10个无重叠视野，使用Olympus显微镜、DP801形态分析软件进行图像采集处理，图像分析仪进行分析，测出Bcl-2、Bax蛋白抗原表达的总面积、阳性细胞数和平均吸光度A，计算其积分吸光度(IA)。

1.2.5Western印迹法检测磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达按每泳道加入总蛋白4 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，目标蛋白转移至硝酸纤维素滤膜上，4℃封闭过夜，加入一抗p-ERK、Bcl-2、Bax、Caspase-3，温箱孵育2 h，漂洗后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗1∶5 000，经过ECL化学发光剂曝光显影，每组实验重复三次，结果使用Gel-Pro4软件进行半定量分析，计算相对光密度值。

1.2.6检测Bcl-2、Bax、Caspase-3基因的表达取冻存肝脏组织4℃解冻以后，放入DEPC处理的EP管中，在低温冰块上将其剪碎，加入1 ml Trizol液体进行组织匀浆。提取总RNA：按照RNAiso Reagent 试剂盒提取小鼠肝脏组织总RNA，通过紫外分光光度计以及琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度、浓度及其完整性。逆转录反应：按照SYBR® ExScriptTM实时定量PCR Kit反转录试剂盒操作方法进行实验：反转录反应42℃,15 min，反转录酶失活反应95℃，2 min。PCR反应：采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)kit试剂盒相应反应体系，总体积为25 μl。引物的序列如下：Bcl-2正义链：5′-AAGCACATCCAATAAAAGCGC-3′，Bcl-2，反义链：5′-GTTATCATACCCTGTTCTCCCG-3′，Bax正义链：5′-GAGACACCTGAGCTGACCTTG-3′,Bax反义链：5′-GAAGTTGCCATCAGCAAACAT-3′，Caspase-3，反义链：5′-AAGGAGCAGCTTTGTGTGTGT-3′,Caspase-3，反义链：5′-AAGAGTTTCGGCTTTCCAGTC-3′；GAPDH正义链：5′-GACAATTTTGGCATCGTG-3′,GAPDH反义链：5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′。分别扩增Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAPDH，每个样本做3个复孔，得到阈循环值(Ct)平均值，计算ΔΔCt值，各个样本mRNA表达水平均以2-ΔΔCT表示。

1.3统计学方法运用SPSS13.0软件包行单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。

2结果

2.1肝脏细胞凋亡计数见图1。经过TUNEL染色以及苏木精复染以后，凋亡细胞呈现棕褐色，正常细胞核呈现蓝染。植物油对照组仅可见极少数散在的凋亡细胞，高剂量组凋亡细胞数明显增加。

图1　小鼠肝脏细胞TUNEL检测(×100)

图2　小鼠肝脏组织中Bcl-2蛋白表达(DAB，×100)

图3　小鼠肝脏组织中Bax蛋白表达(DAB，×100)

2.2肝脏组织中Bcl-2、Bax蛋白表达 如图2，图3所示，Bcl-2、Bax主要表达于细胞质，经图像分析系统分析测得的(IA)值Bcl-2表达随给药剂量增加而降低，Bax与Bcl-2的表达呈相反状态，差异有统计学意义(P<0.05)，但低、中剂量组间无差异(P>0.05)。

2.3各组小鼠肝脏组织中p-ERK、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达小鼠肝脏组织中的p-ERK蛋白随剂量增加表达降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白低剂量组变化不明显，中、高剂量组Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)，Bax蛋白低剂量组变化不明显，中、高剂量组表达明显增高(P<0.05)，该提取物可以使Caspase-3活化，产生活性形式的Cleaved Caspase-3，低剂量时不促进Caspase-3及活化的Caspase-3蛋白表达，中、高剂量组Caspase-3及活化的Cleaved Caspase-3蛋白均增高(P<0.05)。见图4。

2.4小鼠肝脏组织中Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA含量与植物油对照组相比，高剂量组中Bcl-2明显下调，而Bax明显上调(P<0.05)，并呈剂量依赖关系，随剂量增高Bax/Bcl-2比值增大。Caspase-3随剂量增加而呈上调趋势。见表1～表3。

1～4：植物油对照组、低、 中、高剂量组图4　小鼠肝脏组织中凋亡相关蛋白检测

组别CTBcl-2CTGAPDHΔCTBcl-2ΔCTGAPDHΔΔCTBcl-2相对表达量植物油对照组17.21±0.3115.12±0.12-17.29±0.16-17.78±0.120.49±0.050.71低剂量组17.35±0.2315.09±0.05-17.35±0.21-17.81±0.130.66±0.100.63中剂量组18.11±0.2115.04±0.09-16.39±0.19-17.86±0.091.47±0.100.362)高剂量组18.96±0.3315.11±0.11-15.54±0.2417.79±0.112.25±0.120.211)2)

与植物油对照组比较：1)P<0.05；与前一剂量组比较：2)P<0.05，下表同

表2　小鼠肝脏细胞Bax mRNA表达

表3　小鼠肝脏细胞Caspase-3 mRNA表达

3讨论

狼毒大戟是一种有毒中药，近年来许多学者都在其抗肿瘤、抗炎等方面进行了大量的研究，并且取得了实质性的进展。其原植物的水、醇、石油醚等的提取物均有抑制肿瘤发展的作用，报道称其为高效低毒的药品，但本实验发现，其石油醚提取物对小鼠肝脏具有一定的毒性，解剖可见，肝脏大小无明显变化，质地柔软，无粘连，色泽光亮。显微镜下观察肝脏组织变化不明显。随着给药时间和剂量的增加，部分肝小叶内可见细胞核消失，细胞质成深红浓染的嗜酸性小体。个别高剂量小组的小鼠状态仍然良好。TUNEL法检测的小鼠肝脏细胞，发现高剂量组中肝脏细胞发生明显凋亡。

细胞的凋亡发生、发展，受到细胞内凋亡调节蛋白的调控与影响，细胞内凋亡调节蛋白分为促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白两类，细胞是否发生凋亡取决于两种蛋白相互拮抗失衡的状态。目前已知的凋亡调节蛋白中，Bcl-2家族在各类刺激信号引发的凋亡中起到关键的作用〔3,4〕。在细胞线粒体上的Bcl-2与Bax蛋白水平的高低直接关系到细胞凋亡的发生，Bax促进细胞凋亡发生，Bcl-2抑制凋亡。于是有人提出细胞在受到刺激后所表现的的生存能力由Bcl-2与Bax两者的比率决定〔5,6〕,Bcl-2表达水平较高时，比率上调，可形成Bcl-2/Bax的异二聚体，抑制细胞凋亡；Bax表达水平较高时，比率下调，形成Bax/Bax同二聚体，促进细胞凋亡〔6〕。近年来，许多机构的研究表明细胞凋亡的内在变化有一定的规律〔7～10〕。

目前在人类已鉴定了4条MAPK途径：细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)途径，C-Jun基末端激酶(JNK)/应激活化蛋白(SAPK)途径，ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶1(BMK1)途径和p38 MAPK(p38 MAPK)传导途径〔11〕。其中ERK通路主要被分裂原激活,如生长因子与受体结合后,能激活小G蛋白Ras,进而激活Raf→MEK→ERK通路。Ketam等〔12,13〕认为，抑制P38通路的同时可以加强ERK的激活，导致细胞凋亡发生延迟。该实验中，p-ERK蛋白的表达随剂量的增加而降低，有可能参与了凋亡反应的调控。

Caspase是哺乳动物细胞发生凋亡的启动、执行者〔14〕，其中Caspase-3是该酶家族级联下游最关键的凋亡调节蛋白酶，Bcl-2通过干扰细胞色素C的释放进而阻断上游Caspase蛋白酶的激活，从而抑制细胞凋亡的发生〔15〕。Bax作为线粒体膜上离子离子通道的组成部分，使得细胞色素C得以顺利穿过线粒体膜而激活Caspase-9蛋白，进一步激活Caspase-3，最终引起细胞凋亡。

本实验结果证明，狼毒大戟石油醚提取物对小鼠的肝脏细胞产生一定的毒性，随着给药剂量的增加，小鼠肝脏组织发生病理改变，从分子层面上讲，Caspase-3、Bax蛋白表达逐渐的增加，说明狼毒大戟石油醚提取物直接或者间接通过别的信号途径激活了Caspase-3、Bax，并使Bax/Bcl-2比率下调，细胞凋亡明显增多，这一结果与TUNEL的检验结果相一致。其毒性作用机制可能是通过ERK通路调节线粒体上的Bcl-2、Bax蛋白的表达，最终活化Caspase-3，启动凋亡程序。

狼毒大戟是一种近年来研究较多的抗炎、抗肿瘤药物，通过该实验证实了，其存在一定的毒性，但是就其当下对抗肿瘤的效果来说，期待能够通过药物配伍达到提高抗炎、抗肿瘤，并成功减毒的效果。使其在发挥新的药物功能的同时更好地服务于医疗卫生事业。

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〔2014-09-19修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

·基础研究·

Effect of petroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana on the liver cell apoptosis and the expression of p-ERK，Bcl-2，Bax and Caspase-3 in mice

CAI Zhen-Zhen, JIN Ming, YANG Pan-Pan,etal.

Institute Mental Health，Qiqihaer Medical College，Qiqihaer 161006，Heilongjiang, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of petroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana on the liver cells apoptosis in mice and the expressions of phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (p-ERK)，Bcl-2，Bax,Caspase-3 in the liver of mice.MethodsEighty Kunming mice were randomly divided into low dose, middle dose, high dose and the control groups with vegetable oil(0.39, 0.78, 1.55 mg·kg-1·d-1)，20 in each group. Model was made by intraperitoneal injection 1 time/day. In the experiment of 14 days，weight was measured, HE dyeing was used to detect liver pathologic morphology, TUNEL was used to detect liver cell apoptosis. Bcl-2 and Bax protein expression were tested by immunohistochemical staining method. The protein expressions of p-ERK and Caspase-3 were detected by western blot. Real-time PCR was used for quantitative analysis of Bcl-2, Bax and Caspase-3.ResultsCompared with the control group, the weights were decreased significantly, liver cell apoptosis was more obvious, the protein expressions of p-ERK and Bcl-2 were decreased while Bax were increased, the protein expressions of Caspase-3 was activated to Cleaved-Caspase-3 in high dose group(P<0.05).ConclusionsPetroleum ether extracts of Euphorbia fischeriana could result in apoptosis of liver cells in mice. The mechanism may be related to reduce p-ERK and Bcl-2, enhance Bax protein expression, and produce activated Caspase-3 forms of Cleaved-Caspase-3.

【Key words】Euphorbia fischeriana；Apoptosis；Bcl-2

通讯作者：刘吉成(1958-)，男，教授，博士生导师，主要从事抗肿瘤药物研究。

基金项目：国家自然科学 (81573660)

中图分类号〔〕R285〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0001-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.001