发酵型核桃乳生产专用链球菌的选育

赵娟娟 吴荣荣

(衡水学院生命科学系，河北 衡水 053000)

发酵型核桃乳生产专用链球菌的选育

赵娟娟 吴荣荣

(衡水学院生命科学系，河北 衡水 053000)

从发酵面包、白芥丝、泡菜、酱黄瓜中，分离到14株链球菌，经过产酸特性测试，菌株HsS5、HsS6、HsS8、HsS9适合核桃乳发酵。通过菌落形态、菌体形态、生化特性和16S rRNA 基因序列分析，确定4株链球菌均为嗜热链球菌。采用菌株HsS5、HsS6、HsS8、HsS9分别与实验室保存的嗜酸乳杆菌 LA 共同发酵，发酵型核桃乳感官评价分别为96，91，93，86分；且4个发酵核桃乳中9种氨基酸都有不同程度的提高，其中HsS5氨基酸含量增幅最大，由0.67%增加到1.75%。综上所述，菌株HsS5适宜核桃乳的发酵生产。

发酵核桃乳；链球菌；分离；鉴定

核桃营养价值丰富，其中含有大量蛋白质，较高的不饱和脂肪酸，丰富的维生素 B 和 E 及钙、磷、铁等多种人体需要的微量元素，常食用对动脉硬化、高血压、抗衰老有良好的保健作用[1-2]。发酵型核桃乳是以核桃乳为原料，经保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵来提高食品的营养价值，改善风味，提高食品的保藏性和适口性。发酵过程中，核桃乳中的蛋白质被分解成肽、氨基酸，矿物质、B族维生素等物质，赋予食品特殊的香气和风味，并增加了产品的肠道保健功能[3-5]。

目前关于发酵的核桃乳产品，主要是以牛乳或其他为主要原料，添加一定比例的核桃乳发酵制成发酵核桃酸奶。真正用纯核桃乳发酵的很少，仅局限在配方上，且没有研究纯核桃乳的发酵生产工艺，主要是由于缺少专门发酵纯核桃乳的商品发酵剂。

本研究拟从不同来源的材料中分离链球菌，并通过形态特征、生理生化和16S rDNA序列分析，确定其分类地位，将鉴定后的菌株进行产酸特性和核桃乳发酵试验，从而确定适合核桃乳发酵的链球菌菌株[6]，旨在为发酵核桃乳产品开发提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集

发酵面包、白芥丝、泡菜、酱黄瓜：市售。

1.2 培养基

MC培养基：酵母粉3.0 g/L，牛肉粉3.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，大豆蛋白胨5.0 g/L，乳糖20.0 g/L，碳酸钙10.0 g/L，1%中性红溶液5.0 g/L，加入1 000 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.0，加入中性红溶液。分装后121 ℃高压灭菌15～20 min。固体培养基需加入琼脂1.3%～1.5%；

PY培养基：蛋白胨5.0 g/L，胰酶水解酪蛋白5.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，盐溶液40.0 g/L，无水CaCl20.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.48 g/L，K2HPO41.0 g/L NaHCO310.0 g/L，NaCl 2.0 g/L。分装后121 ℃高压灭菌20 min；

碳水化合物发酵培养基：蛋白胨10.0 g/L，吐温80 0.1 g/L，酵母膏2.5 g/L，1.6%的溴甲酚紫液1.0 g/L，分别按表1加入不同碳源，调pH=6.8，分装试管后按其相应的时间在114 ℃高压蒸气灭菌。

表1 碳水化合物发酵培养基

1.3 仪器与设备

PCR扩增仪：Takara Thermal Cycler Dice TP600型，日本TaKaRa公司；

电泳仪：Mupid型，美国Major Science公司；

电泳成像装置：ImageMaster VDS型，安发玛西亚生物技术公司；

DNA测序仪：ABI PRISM3730XL DNA Sequencer型，美国应用生物系统公司；

pH计：MP-6100型，盐城澳鼎仪器制造有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 链球菌的分离纯化 上述的植物源产品过滤后吸取1 mL(面包为1 g)，用无菌生理盐水按10倍稀释至10-5，10-6，10-7。取0.1 mL稀释液涂布在MC培养基上，37 ℃倒置培养48 h，划线分离纯化获得菌株，经镜检为纯培养物后转入固体斜面上，一部分于甘油保存，一部分在4 ℃冰箱中保存。

1.4.2 菌种的染色和形态观察 将菌种接种于MC培养基上，观察菌落的形态。用无菌接种环取一环菌染色后用油镜进行观察，观察菌株的形态。

1.4.3 链球菌代谢特性

(1) 过氧化氢酶试验：在MC培养基的菌落上滴加3%的H2O2，观察有无气泡产生。

(2) 精氨酸水解试验：将1～2 d MC液体培养物接种于精氨酸水解的培养基，用无菌的石蜡矿物油密封，倒置37 ℃下培养72 h后，观察结果。

(3) 七叶苷水解试验：PY培养基中加入终浓度5 g/L的七叶苷，灭菌。将活化好的培养液接种于试管，37 ℃培养24～72 h后。取少量七叶苷培养液于比色盘内，以未接种培养基作为对照，滴加少量柠檬酸铁溶液，显示黑色为阳性反应，不显色则为阴性反应。

(4) 碳水化合物发酵试验：按1%接种量，将活化好的培养液接种于不同碳水化合物的培养基中，37 ℃培养24～72 h。培养液变黄为阳性反应，反之为阴性反应[7-8]。

1.4.4 链球菌的16S rRNA基因序列测序

(1) 变性：从培养基中挑取菌体于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中变性后离心取上清作为模板。反应条件为80 ℃，15 min。

(2) PCR 扩增：使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176)，进行 PCR 扩增。

(3) 测序：使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(Code No.9762)切胶回收片段进行测序。

CTG497-S5以SEQ Forward、SEQ Internal和16S SEQF1为引物进行DNA测序；其余样品均以SEQ Forward、SEQ Internal和SEQ Reverse为引物进行DNA测序。

1.4.5 核桃乳的发酵试验及质量评定

(1) 酸度测定：取乳样10 mL，加入20 mL蒸馏水和2～3滴酚酞试剂，用标定过的0.100 4 mol/L NaOH溶液进行滴定，酸度以吉尔涅尔度(T)表示。

(2) 感官评定：以色泽、香气、滋味以及形态作为核桃乳感官评分指标，邀请10人进行试饮评判。评分结果取其平均值计算。具体评定细则见表2。

表2 口感外观评分的标准

(3) 氨基酸的评定：采用分离获得的链球菌与实验室保存的嗜酸乳杆菌LA，进行核桃乳发酵试验，对发酵后氨基酸含量进行测定，并与未发酵核桃乳的营养质量进行比对评价。

2 结果与分析

2.1 链球菌的分离

由表3可知，共分离到乳酸菌14株，其中来自市售泡菜的4株，占总分离菌株的29%；来自市售发酵面包的3株，占总数的21%；来自市售酱黄瓜的2株，占总数的14%；来自市售白芥丝的5株，占总数的36%。链球菌形态，主要以卵圆形，细胞的排列呈对状、短链、中等长链、长链等不同的排列方式。

2.2 链球菌的初步筛选

将菌株为HsS1～HsS14分别与实验室保存的嗜酸乳杆菌LA进行核桃乳发酵试验，发酵产品酸度结果见表4。

由表4可知，经过菌株HsS5、HsS6、HsS8、HsS9分别和嗜酸乳杆菌LA共同发酵后，产品酸度分别为42，41，43，45T，经过感官评分，认为酸度在40～45T的样品，酸甜可口，组织状态均一，故可作为后续研究用菌株。

表3 链球菌形态特征

表4 核桃乳样品酸度测定结果

2.3 链球菌的鉴定

2.3.1 链球菌的形态特征 由图1～4可知，从发酵面包、白芥丝、泡菜、酱黄瓜等分离得到的链球菌株，细胞为球形或卵圆形，直径0.7～0.9 μm，在显微油镜下细胞的排列呈对状、短链、中等长链、长链等不同的排列方式。圆形菌落，深红色，表面光滑，边缘整齐，直径约1 mm，革兰氏阳性。

2.3.2 代谢特性试验结果 将链球菌HsS5、HsS6、HsS8、HsS9按照文献[9]677-679进行代谢特性的测定，结果见表5。

由表5可知，4株菌的过氧化氢酶试验、精氨酸和七叶苷水解试验阴性，淀粉试验阳性；碳水化合物发酵试验中葡萄糖、乳糖和蔗糖能被链球菌利用。以上的代谢特性与文献[9]694所描述的嗜热链球菌特征一致，因此初步鉴定4株链球菌为嗜热链球菌。

图1 HsS5的菌体和菌落形态

图2 HsS6的菌体和菌落形态

图3 HsS8的菌体和菌落形态

图4 HsS9的菌体和菌落形态

2.3.3 16S rRNA基因特异性扩增结果 将4个菌株的16S rDNA 序列提交到GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ，结果见图5。

基因序列比对和分析结果为：菌株HsS5与嗜热链球菌(FR875178.1)的片段相似性达到100%，菌株HsS6与嗜热链球菌(HM059005.1)的片段相似性达到99%，菌株HsS8与嗜热链球菌(HM058273.1)的片段相似性达到100%，菌株HsS9与嗜热链球菌(CP002340.1)在66 845～68 289 bp的片段的相似性达到100%。结合菌株形态及代谢特性结果，确定HsS5、HsS6、HsS8、HsS9均为嗜热链球菌。

表5 链球菌的代谢特性†

† +表示阳性；-表示阴性。

M. DNA Marker DL2 000 1. HsS5的16S rRNA基因 2. HsS6的16S rRNA 基因 3. HsS8的16S rRNA基因 4. HsS9的16S rRNA 基因 +. 阳性对照 -. 阴性对照

图5 链球菌的16S rRNA基因

Figure 5 16S rRNA of streptococcus

2.4 链球菌的核桃乳发酵试验

2.4.1 发酵核桃乳的感官评定结果 将菌株HsS5、HsS6、HsS8和HsS9与实验室保存的嗜酸乳杆菌LA进行核桃乳发酵试验，发酵后核桃乳样品分别标记为样品5、6、8、9，感官评价结果见表6。

由表6可知，菌株HsS5与实验室保存的嗜酸乳杆菌LA共同发酵的样品5，具有核桃香气，滋味酸甜适口、乳酸味浓且柔和，色泽略显灰色，所形成的形态均匀一致。感官评定结果为96分，相比其它菌株的感官评分结果高。

表6 感官评分结果

2.4.2 发酵核桃乳的氨基酸测定结果 将菌株HsS5、HsS6、HsS8和HsS9与实验室保存的嗜酸乳杆菌LA进行核桃乳发酵试验，不同菌株发酵的核桃乳样品的分别标记为样品5、6、8、9，氨基酸测定结果见表7。

表7 氨基酸测定结果

由表7可知，经过发酵后的核桃乳的9种氨基酸含量均有不同程度的提高。其中经菌株HsS5搭配嗜酸乳杆菌LA发酵后赖氨酸的含量高达0.35%，是未发酵前赖氨酸含量(0.05%)的7倍；亮氨酸的含量，由原来的0.17%提高到了0.52%，是未发酵核桃乳的3倍；因此，菌株HsS5更适宜用在核桃乳发酵中。赖氨酸是核桃的第一限制性氨基酸，亮氨酸有助于血糖控制，重点考虑了这两种，综合感官评价分数，选择了HsS5。

3 结论

本研究从特定植物来源的材料中，采用选择性分离培养基，获得了HsS5、HsS6、HsS8、HsS9 4株链球菌菌株。通过生理生化特性和16S rRNA基因序列分析，上述菌株均为嗜热链球菌。对鉴定后的菌株进行发酵研究，结果表明，采用菌株HsS5与实验室保存的嗜酸乳杆菌LA发酵得到的纯核桃发酵乳，感官评价最高，且具有较高的营养价值。后续将进一步分析纯核桃发酵乳其它营养成分的指标，促进该菌株的广泛应用。

[1] 徐效圣. 核桃乳生产工艺研究[D]. 乌鲁木齐: 新疆农业大学, 2010: 11-18.

[2] 王子娜. 核桃乳酸菌发酵饮料的工艺研究[D]. 北京: 北京林业大学, 2012: 1-2.

[3] 王喜萍, 郑凤荣, 张文英, 等. 山核桃乳饮料的研制[J]. 食品与机械, 2004, 30(1): 38-39.

[4] 丁涓, 蒲洋, 张丽, 等. 核桃酸奶营养价值及工艺的研究[J]. 科技信息, 2009(35): 860.

[5] 郜洪涛, 吕嘉枥, 闫肃, 等. 嗜热链球菌对酸奶发酵的影响及应用前景[J]. 中国酿造, 2010(11): 5-8.

[6] 敬思群. 乳酸菌发酵核桃乳的研究[J]. 食品与发酵工业, 2006(7): 157-160.

[7] 李公美, 夏娌君, 单晓枫, 等. 酸奶中嗜热乳酸链球菌的分离鉴定及益生特性研究[J]. 安徽农业科学, 2010(11): 2 615-2 616.

[8] 王立平. 瑞士乳杆菌酪蛋白源活性肽制备及其生理功效研究[D]. 北京: 北京林业大学, 2008: 27-28.

[9] BUCHANAN R E. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 8版. 中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组, 译. 北京: 科学出版社, 1984.

Screening of streptococcus used for the fermented walnut mink drink

ZHAO Juan-juanWURong-rong

(DepartmentofLifeScience,HengshuiUnivercity,Hengshui,Hebei053000,China)

In this study, 14Streptococcusstrains were isolated from sourdough bread, white silk mustard, pickles and cucumber sauce. Among those strains, four strains marked as HsS5, HsS6, HsS8, HsS9 could be used for the fermentation of the walnut milk after acid feature test, and they were identified asStreptococcusthermophilusthrough their morphologic, physiological biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence. The scores of sensory evaluation of these fermented walnut milks produced by HsS5, HsS6, HsS8, HsS9 withLactobacillusacidophilusLA were 96, 91, 93, 86, respectively. Moreover, the contents of nine kinds of amino acid were found increased at different degrees in these four kinds fermented walnut milk, especially in HsS5, increased most significantly from 0.67% to 1.75%. According to the above results, strain HsS5 was more valuable for fermented walnut milk production than other strains.

fermented walnut milk; streptococcus; separation; identification

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.013

赵娟娟(1982—)，女，衡水学院讲师，硕士。 E-mail：zhaojuanjuan456@163.com

2016-05-13