提取pH对鳙鱼鱼鳞明胶功能性质的影响

沙小梅 涂宗财, 王 辉 张 露 黄 涛 胡姿姿

(1. 江西师范大学功能有机小分子教育部重点实验室，江西 南昌 330022；2. 江西师范大学生命科学学院，江西 南昌 330022；3. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

提取pH对鳙鱼鱼鳞明胶功能性质的影响

沙小梅1,2涂宗财1,2,3王 辉3张 露1,2黄 涛3胡姿姿1,2

(1. 江西师范大学功能有机小分子教育部重点实验室，江西 南昌 330022；2. 江西师范大学生命科学学院，江西 南昌 330022；3. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

研究了制备过程中pH值(3.0～7.0)对鳙鱼鱼鳞明胶组成、得率和功能性质(凝胶强度、胶融温度和浊度)的影响，并对鱼鳞明胶的分子量分布进行了探究。结果表明，pH值在3.0～7.0时均能得到高品质的鱼鳞明胶(高蛋白质含量、低灰分含量)。随着pH值的增加，鳙鱼鱼鳞明胶得率逐渐降低，浊度逐渐增加，凝胶强度和胶融温度先增加后减小。此外，鳙鱼鱼鳞明胶的凝胶强度与分子量分布具有一定的相关性。上述研究结果可为特定用途的鱼明胶制备提供技术支撑。

鳙鱼；鱼鳞明胶；得率；凝胶强度；胶融温度；浊度；分子量分布

因具有良好的凝胶特性和普通蛋白所呈现的功能性质，明胶被广泛应用于食品、制药、生物医学、照相和化妆品行业[1]。目前，商业明胶主要来源于哺乳动物，如猪皮和牛皮[2]。由于疯牛病和宗教信仰等因素，哺乳动物明胶的应用受到一定限制，许多科研工作者[3-5]已经致力于开发哺乳动物明胶替代物。因具有与哺乳动物明胶类似的功能性质，鱼明胶成为颇具前景的哺乳动物明胶替代物[6-7]。另外，制备鱼明胶的原料主要来源于鱼加工过程中产生的副产物(如鱼皮、鱼鳞等)，因此，鱼明胶具有价格低廉的优势[8]。

鱼鳞是鱼制品加工过程中产生的主要废弃物之一，约占鱼体重量的2%。近些年，利用鱼鳞制备明胶的研究报道日益增多，主要集中在鱼鳞脱钙[9]、预处理[10]和制备工艺[11]等方面。在鱼鳞明胶制备方面，Wangtueai等[11]优化了狗母鱼鱼鳞明胶的制备工艺(包括NaOH浓度、预处理时间、制备温度、制备时间)；Le等[12]研究了制备温度和时间对竹荚鱼鱼鳞明胶得率和膜特性的影响；课题组[13]前期研究了超声波辅助提取对鳙鱼鱼鳞明胶得率和凝胶性能的影响。然而，迄今为止，研究制备过程中pH值对鱼鳞明胶功能性质影响的报道并不多，且未见系统研究pH值对鳙鱼鱼鳞明胶功能性质影响的相关报道。

鳙鱼(Hypophthalmichthysnobilis)是一种产自亚洲的淡水鱼，广泛分布于湖泊和河流中。鳙鱼已经被引入位于欧洲、南美洲和北美洲的70多个国家[14]。在中国，鳙鱼与青鱼、鲢鱼和草鱼一起，并称为四大家鱼[15]。据统计[16]，2014年，中国鳙鱼养殖年产量达到3.20×106t。除鲜销外，鳙鱼主要被用于加工成鱼制品，产生的下脚料有待于加工利用。因此，本研究以鳙鱼鱼鳞为原料，研究制备过程中不同的pH值对鱼鳞明胶得率、凝胶强度、胶融温度、浊度、分子量分布等特性的影响，旨在为鳙鱼鱼鳞的高值化利用提供依据，为高品质鳙鱼鱼鳞明胶的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳙鱼鱼鳞：市售；

蛋白分子量Marker：分子量范围为10～200 kDa，美国Thermo Scientific公司；

盐酸：分析纯，上海试剂一厂；

Tris-HCl缓冲液(pH 6.8和8.8)：分析纯，北京索莱宝科技有限公司；

考马斯亮蓝R-250：分析纯，北京索莱宝科技有限公司；

十二烷基硫酸钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

其他所用试剂均属于分析纯或更高的等级。

1.2 仪器与设备

质构分析仪：CT3型，美国Brookfield公司；

电泳仪：BIO-RAD型，美国BIO-RAD公司；

程序控制高低温恒温槽：CXDC-0510型，南京舜玛仪器设备有限公司；

紫外-可见分光光度计：T6型， 北京普析通用仪器有限公司；

凯氏定氮仪：KDY-9820型， 厦门精艺兴业科技有限公司；

冷冻干燥机：LGJ-1型， 北京亚泰科隆仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼鳞的脱钙处理 将鱼鳞置于组织捣碎机中捣碎5 min，以去除鱼鳞表面的银白色物质。接下来对鱼鳞进行脱钙处理，脱钙工艺：盐酸浓度0.5 mol/L、料液比1∶25(g/mL)、脱钙时间1 h。脱钙后，进一步清洗鱼鳞以去除残存的酸液，以用于下一步的鱼鳞明胶提取。

1.3.2 鱼鳞明胶的制备 将脱钙后的湿鱼鳞和去离子水按1∶3(g/mL)混合，用1 mol/L的盐酸溶液分别调pH值至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0(当pH值高于7.0，制备得到的鱼鳞明胶溶液易呈现白色，影响鱼鳞明胶产品的透明度，因此本试验控制鱼鳞明胶的制备pH值不高于7.0；当pH值低于3.0，强酸环境易促使胶原蛋白过度水解，进而影响明胶品质)，置于60 ℃的水浴锅2 h进行鱼鳞明胶的提取。制备结束后，过滤去除鱼鳞残渣，将滤液置于60 ℃的旋转蒸发仪中，将滤液体积蒸发至原体积的1/3。冻干浓缩后的鱼鳞明胶溶液，备用。

1.3.3 鱼鳞明胶组成成分的测定 根据Cunniff[17]的方法，分别测定制备过程中不同pH值条件下得到的鱼鳞明胶水分、灰分和蛋白质含量。

1.3.4 鱼鳞明胶得率的测定 根据Tabarestani等[2]，修改如下：利用双缩脲法，测定540 nm处的吸光值以计算提取液中的蛋白质含量。利用牛血清白蛋白作为标准蛋白，绘制蛋白质含量测定的标准曲线。鱼鳞明胶的得率按式(1)进行计算：

(1)

式中：

Y——鱼鳞明胶的得率，%；

c——明胶提取液中的蛋白质浓度，g/mL；

V——明胶提取液的体积，mL；

M——脱钙后的鱼鳞干重，g。

1.3.5 鱼鳞明胶凝胶强度的测定 根据Giménez等[18]，修改如下：在55 ℃水浴锅中利用去离子水溶解鱼鳞明胶制备成66.7 g/L的溶液，在10 ℃下冷却16～18 h。采用CT3质构分析仪以直径1.27 cm的平底圆柱形探头测定鱼鳞明胶的凝胶强度，测试速度为1 mm/s。当鱼鳞明胶样品被挤压4 mm时产生的最大受力(g)即为凝胶强度。所测样品的直径大约为33 mm，高度大约为22 mm。

1.3.6 鱼鳞明胶胶融温度的测定 根据Muyonga等[19]，修改如下：在55 ℃水浴锅中利用去离子水溶解鱼鳞明胶制备成66.7 g/L的溶液，倒入带螺帽的试管(12 mm × 100 mm)，在试管顶部留出部分空间，盖上螺帽，倒置于4 ℃冰箱16～18 h。将装有鱼鳞明胶的试管转移至10 ℃恒温槽，此时，试管内的空间(即不含有明胶的部分)位于试管底部。以0.5 ℃/min的速度提高恒温槽的温度，当试管底部的气泡开始往上运动时记录温度，即为鱼鳞明胶的胶融温度。

1.3.7 鱼鳞明胶浊度的测定 根据Kittiphattanabawon等[20]，修改如下：用pH值5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液(0.2 mol/L)将鱼鳞明胶配制成66.7 g/L的溶液，采用紫外-可见分光光度计测定360 nm处的吸光值用以表示鱼鳞明胶的浊度。

1.3.8 鱼鳞明胶分子量的测定 采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)测定鱼鳞明胶的分子量分布，试验方法是在Balti等[3]报道的方法基础上进行微小修改而获得。浓缩胶和分离胶的浓度分别为50，75 g/L。制备5 mg/mL的鱼鳞明胶样品，在95 ℃加热5 min，再经离心机以5 000×g的速度离心10 min，取10 μL溶液上样。

1.3.9 数据的统计学分析 所有试验数据都是来源于3个平行样测得的结果取平均值，数据通过SPSS 17.0进行分析，选取Duncan’s test用于显著性分析(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 鱼鳞明胶的组成分析

由表1可知，鳙鱼鱼鳞明胶的水分含量为3.88%～5.50%，蛋白质含量为93.55%～94.75%(以湿基计)，灰分含量为0.21%～0.86%(以湿基计)。虽然不同pH值下制备得到的鱼鳞明胶组成稍有差别，但所有样品的蛋白质含量均高于90%、灰分含量均低于1%，表明提取pH值在3.0～7.0时均能得到高蛋白质含量、低灰分含量的鱼鳞明胶。鱼鳞含有大量的无机矿物质(以羟基磷灰石为主)，而本试验所有样品的灰分含量均低于1%，主要原因在于脱钙处理去除了鱼鳞的绝大部分矿物质成分。

本研究中，鳙鱼鱼鳞明胶的蛋白质含量(93.55%～94.75%)高于枪乌贼鱼皮明胶(87.57%～89.52%)[8]、胡子鲶鱼皮明胶(77.88%)[21]、淡水鲨鱼鱼皮明胶(80.02%)[21]、乌贼鱼皮明胶(91.35%)[3]等的蛋白质含量。此外，一般情况下，食用明胶恰当的水分和灰分含量应分别低于15%和2%[8, 13]，本试验中不同pH值条件下制备的鳙鱼鱼鳞明胶水分和灰分含量均低于上述指标。以上结果表明鳙鱼鱼鳞明胶可作为一种优质的可食用明胶资源。

表1 不同提取pH值下鱼鳞明胶的组成分析†

† 同一列不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。

2.2 提取pH值对鱼鳞明胶得率的影响

由图1可知，当pH值在3.0～7.0时，随着pH值的增加，鳙鱼鱼鳞明胶的得率显著性降低(P<0.05)。当pH值为3.0时，鱼鳞明胶的得率为42.94%，而pH值提升至7.0时，鱼鳞明胶的得率则降至27.92%。Cho等[22]研究了提取pH值(4.0～9.0)对斑鳐鱼皮明胶得率的影响，结果表明，当pH值为4.0时，鱼皮明胶的得率最高。上述结果表明，低pH值有利于高得率鱼明胶的制备。

蛋白质能在酸性、碱性、酶等条件下发生水解形成多肽。在明胶制备过程中，在酸性条件下，H+会攻击鱼鳞胶原蛋白的肽键，促使其断裂形成分子量不等的蛋白质片段，即产生具有凝胶特性的明胶。pH值越低，能够断裂胶原蛋白肽键的H+就越多，因此，鱼鳞明胶的得率越高。低pH值虽然有利于胶原蛋白断裂形成明胶(即提高鱼鳞明胶的得率)，但是可能会在一定程度上影响鱼鳞明胶的功能性质，因此，进一步研究了pH值对鱼鳞明胶功能性质(凝胶强度、胶融温度等)的影响。

不同字母表示数值间存在显著性差异(P<0.05)

2.3 提取pH值对鱼鳞明胶凝胶强度的影响

由图2可知，当pH值在3.0～7.0时，随着pH值的增加，鳙鱼鱼鳞明胶凝胶强度呈现先增加后降低的趋势。当pH值为3.0时，鱼鳞明胶的凝胶强度最低，为762.41 g；当pH值为4.0，5.0，6.0时，制备得到的鱼鳞明胶凝胶强度最高，且三者间不存在显著性差异(P>0.05)；而pH值为7.0时，鱼鳞明胶的凝胶强度为831.11 g，低于pH值4.0、5.0和6.0条件下制备得到的鱼鳞明胶凝胶强度。相比之下，Cho等[22]的研究结论略有不同，其结果显示，当制备pH值为6.0和7.0时，斑鳐鱼皮的凝胶强度最高，产生不同试验结果的原因可能是明胶制备的原料不同，对酸碱度的耐受程度有所不同。

制备过程中pH值对鱼鳞明胶凝胶强度的影响可能与其分子量变化情况有关，较强酸性条件下(如pH值为3.0时)，胶原蛋白易降解成较低分子量的片段[23]，将影响明胶分子交联形成凝胶网络结构的能力，因此，鱼鳞明胶呈现出较低的凝胶强度。在中性条件下(如pH值为7.0时)，加热降解可能是影响胶原蛋白裂解成明胶的主要因素。热处理可能会使制备得到的鱼鳞明胶呈现出较低含量的α链或β链，进而影响鱼鳞明胶的凝胶强度。不同pH值条件下制备得到的鱼鳞明胶样品的分子量分布情况将通过SDS-PAGE试验进行分析论证。

2.4 提取pH值对鱼鳞明胶胶融温度的影响

由图3可知，与pH值对鱼鳞明胶凝胶强度的影响趋势类似，随着pH值的升高，鱼鳞明胶的胶融温度先增加后减少。当pH值为4.0，5.0，6.0时，鳙鱼鱼鳞明胶的胶融温度最高，分别为28.40，28.35，28.40 ℃，且三者间不存在显著性差异(P>0.05)；当pH值为3.0时，鳙鱼鱼鳞明胶的胶融温度最低，为26.95 ℃。胶融温度的主要影响因素在于氨基酸组成、α链/β链比例、分子量分布等[13]，pH值较低的情况下造成鱼鳞明胶胶融温度较低的原因可能是酸性条件下高分子量的鱼鳞明胶组分发生降解，使得其形成凝胶网络结构的能力变弱，因此胶融温度降低。中性条件下得到的鱼鳞明胶胶融温度略有下降，原因可能是此条件下形成的明胶氢离子含量较少，氢键较弱，使得凝胶在较低温度下融化。胶融温度是明胶的重要特性，本试验中，鳙鱼鱼鳞明胶的胶融温度为26.95～28.40 ℃，高于Norziah等[24]报道的商业鱼明胶胶融温度(23.7～25.6 ℃)，低于猪皮明胶和牛皮明胶的胶融温度(分别为31.5，30.0 ℃)[25]。因此，鳙鱼鱼鳞明胶可作为一种颇具应用前景的商业鱼明胶，但仍需进行一定的修饰改性才能成为哺乳动物明胶替代物。

不同字母表示数值间存在显著性差异(P<0.05)

Figure 2 The effect of pH value in preparation process on gel strength of gelatin from fish scale

不同字母表示数值间存在显著性差异(P<0.05)

Figure 3 The effect of pH value in preparation process on melting temperature of gelatin from fish scale

2.5 提取pH值对鱼鳞明胶浊度的影响

浊度是影响明胶在食品领域应用(如明胶作为增稠剂添加于食品中)的一个重要因素[21]，高浊度会在较大程度上降低明胶的品质。由图4可知，随着pH值的升高，鳙鱼鱼鳞明胶的浊度逐渐增加。当pH值为3.0和4.0时，鱼鳞明胶的浊度最低，即此时鱼鳞明胶溶液的澄清度最高；当pH值为7.0时，鱼鳞明胶的浊度最高。

Kittiphattanabawon等[20]的研究结果表明，黑边鳍真鲨皮明胶的浊度增加与其凝胶强度降低的趋势呈现出一致性。然而，本试验中，在不同pH值诱导下，鳙鱼鱼鳞明胶浊度增加与其凝胶强度变化的趋势并不完全相同，表明鳙鱼鱼鳞明胶的浊度和凝胶强度之间并不存在明显的相关性。当pH值较高(如pH值为7.0)时，鱼鳞明胶的浊度较高可能和矿物质(如钙离子)含量及溶解性有关。表1的灰分含量结果显示，提取pH值为7.0时，鱼鳞明胶的灰分含量最高，与浊度最高的结果一致。

不同字母表示数值间存在显著性差异(P<0.05)

Figure 4 The effect of pH value in preparation process on turbidity of gelatin from fish scale

2.6 提取pH值对鱼鳞明胶分子量分布的影响

课题组前期研究[13, 26]结果表明，鳙鱼鱼鳞明胶具有典型的明胶分子量分布图，即含有清晰的α链条带(α1和α2)、β链条带(由两条α链共价交联形成)和高分子量聚合物(HMWP)条带。由图5可知，当pH值为5.0时，鱼鳞明胶呈现了典型的α1链、α2链、β链和HMWP条带；当pH值为4.0和6.0时，鱼鳞明胶仍呈现出了较为清晰的上述典型条带；然而，当pH值为3.0和7.0时，鱼鳞明胶的β链条带较为模糊，表明鱼鳞明胶中β链含量有所减少。此外，与其他条件相比，pH值为3.0时制备得到的鱼鳞明胶呈现出了相对较浅的α链条带。

鱼鳞明胶的分子量分布可能会在一定程度上影响其凝胶强度。课题组[26]前期运用硫酸铵分级沉淀法分离得到了5个不同凝胶强度的鱼鳞明胶组分，并对其分子量分布进行了研究，结果表明，高凝胶强度的鱼鳞明胶组分分子量较大，且含有更为明显的α链和β链条带。此外，较多的研究报道[8, 13, 27-28]获得了同样的结论，即高分子量组分、α链和β链有助于凝胶网络的形成，进而呈现出较高的凝胶强度。在本试验中，不同pH值条件下制备得到的鱼鳞明胶凝胶强度和分子量分布呈现出了较为明显的相关性。pH值为4.0，5.0，6.0时，制备得到的鱼鳞明胶具有较高的凝胶强度(见图2)，且呈现出清晰的α链、β链和HMWP条带。pH值为7.0时制备得到的鱼鳞明胶虽然含有清晰的α链条带，但是β链和HMWP条带有所变浅，其表观出的凝胶强度也有所降低。pH值为3.0时制备得到的鱼鳞明胶凝胶强度最低，同时也呈现出了最少含量的α链、β链和HMWP条带。

3 结论

制备过程中的pH值能在很大程度上影响鳙鱼鱼鳞明胶得率和功能性质，而国内外对此研究并不多见。就组成成分而言，pH值在3.0～7.0时均能制备得到高品质的鱼鳞明胶，即蛋白质含量均高于90%、灰分含量均低于1%。当pH值从3.0增加到7.0时，鳙鱼鱼鳞明胶得率逐渐降低，浊度逐渐增加，凝胶强度和胶融温度先增加后减小。因此，制备鳙鱼鱼鳞明胶时应根据其特定用途选择合适的pH值。例如，需获得高得率、澄清度较好的鱼鳞明胶时，可选择pH值为3.0进行制备。与众多的文献报道一致，本研究结果亦显示鱼明胶的凝胶强度与其分子量分布情况有关。然而，试验结果证实鳙鱼鱼鳞明胶的浊度和凝胶强度之间不存在明显的相关性。本研究的开展能为鳙鱼鱼鳞明胶的工业化生产提供一定的技术支撑。此外，课题组后续将进一步研究pH值对鱼鳞明胶分子结构的影响，以解析制备过程中不同pH值作用下鱼胶原蛋白断裂形成明胶的原理，用于指导鱼明胶的定向化制备。

HMWP. 高分子量聚合物

Figure 5 The effect of pH value in preparation process on molecular weight distribution of gelatin from fish scale

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Effect of pH value in preparation process on functional properties of gelatin from bighead carp (Hypophthalmichthysnobilis) scale

SHA Xiao-mei1,2TUZong-cai1,2,3WANDHui3ZHANGLu1,2HUANGTao3HUZi-zi1,2

(1.KeyLaboratoryofFunctionalSmallOrganicMolecule,MinistryofEducation,JiangxiNormalUniversity,Nanchang,Jiangxi330022,China; 2.CollegeofLifeScience,JiangxiNormalUniversity,Nanchang,Jiangxi330022,China; 3.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,NanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330047,China)

The effect of pH value in preparation process on proximate composition, yield and functional properties including gel strength, melting temperature and turbidity of gelatin from bighead carp (Hypophthalmichthysnobilis) scale was investigated. Moreover, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was used to evaluate the change of molecular weight distribution for fish gelatin. The results indicated that regardless of pH values in the range of 3.0～7.0 for preparation process, fish gelatin had a high quality with high protein content and low ash content. With pH value increasing, the yield of fish gelatin gradually decreased, however, turbidity showed an increased trend. When pH value increased from 3.0 to 7.0, gel strength and melting temperature of fish gelatin increased at first, and then decreased. In addition, gel strength of gelatin from bighead carp scale was related to molecular weight distribution in some extent. Above results in this study could give some technical support in the preparation of fish gelatin with special application.

gelatin from bighead carp scale; yield; gel strength; melting temperature; turbidity; molecular weight distribution

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.003

国家自然科学基金(编号：31660487)；江西省重点研发计划项目(编号：20161BBF60096)；江西省现代农业产业技术体系建设专项(编号：JXARS-03)；江西省教育厅科学技术研究项目(编号：GJJ150303)

沙小梅，女，江西师范大学讲师，博士。

涂宗财(1965—)，男，江西师范大学教授，博士。 E-mail:tuzc_mail@aliyun.com

2016-08-30