HPLC法测定阿图什无花果叶汁中3种香豆素的含量

迪丽阿热姆·尼加提， 阿吉艾克拜尔·艾萨

(1新疆医科大学药学院；2中国科学院新疆理化技术研究所干旱区植物资源化学重点实验室， 乌鲁木齐　830011)

HPLC法测定阿图什无花果叶汁中3种香豆素的含量

迪丽阿热姆·尼加提1,2， 阿吉艾克拜尔·艾萨1,2

(1新疆医科大学药学院；2中国科学院新疆理化技术研究所干旱区植物资源化学重点实验室， 乌鲁木齐830011)

摘要：目的高效液相色谱法(HPLC法)测定阿图什无花果叶汁中伞形花内酯、佛手柑内酯和补骨脂素3种香豆素的含量。方法色谱柱Sunfire C18ODS (250 mm×4.6 mm,5 μm)，流速1 mL/min，检测波长为220 nm，柱温30℃，流动相为乙腈-水，流动相配比为0~10 min，乙腈25%；10~12 min，乙腈由25%梯度增至50%；12~20 min，乙腈50%；20~22 min，乙腈由50%梯度增至100%。结果伞形花内酯、佛手柑内酯和补骨脂素分别在0.001~0.019 mg/mL(R2=0.999 9)、0.01~0.19 mg/mL(R2=0.999 7)和0.01~0.19 mg/mL(R2=0.999 9)范围内与峰面积呈良好线性关系，平均回收率分别为98.09%(RSD=0.85%)、102.07% (RSD=1.07%)和101.00%(RSD=0.71%)。阿图什无花果叶汁中伞形花内酯、佛手柑内酯和补骨脂素3种香豆素的含量分别为1.09、9.89、24.58 mg/g。结论HPLC法简便、准确、稳定，可用于测定无花果叶汁中伞形花内酯、佛手柑内酯和补骨脂素的含量。

关键词：无花果叶汁； 香豆素； 高效液相色谱法

Determination of three coumarins in Ficuscarica L. Latex by HPLC methods

Dilaram Nijat1,2, Hajiakber Aisa1,2

(1SchoolofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity;2KeyLaboratoryofPlantResources

andChemistryinAridRegions,XinjiangTechnicalInstituteofPhysicsandChemistry,

ChineseAcademyofSciences,Urumqi, 830011,China)

Abstract:ObjectiveTo determine the contents of Umbelliferone, Bergapten and Psoralen in Ficuscarica Latex by HPLC method. MethodsHPLC method conditions and procedure: Sunfire C18ODS column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), with the flow rate of 1.0 mL/min, detectional wavelength at 220 nm under column temperature 30℃; acetonitrile-H2O as the mobile phase, 0~10 min, acetonitrile as 25%; afeter 10~12 min, acetonitrile as going up to 25%~50% gradually; 12~20 min, acetonitrile as 50%; 20~22 min, acetonitrile as going up to 50%~100% gradually. ResultsThere was a good linear relationship over the concentration range of (0.001~0.019) mg/ml, R2=0.999 9 for Umbelliferone, (0.01~0.19) mg/ml, R2=0.9997 for Bergapten and (0.01~0.19) mg/ml, R2=0.9999 for Psoralen. The average recovery rates of Umbelliferone, Bergapten and Psoralen were 98.09% (RSD=0.85%), 102.07% (RSD=1.07%) and 101.00% (RSD=0.71%), respectively. The contents of Umbelliferone, Bergapten and Psoralen were 1.09, 9.89 and 24.58 mg/g. ConclusionThe method is simple, accurate and stable, which could be applied to the determination of quality control.

Keyword:FicuscaricaL. Latex; Coumarins; HPLC

无花果，英文名为Fig，拉丁名为(Ficuscarica L.)，别称映日果、奶浆果、蜜果，属桑科榕属落叶乔木或灌木。全株含白色乳汁，花隐于囊状总花托内，外观只见果而不见花，故名无花果[1]。无花果原产于阿拉伯，后传入叙利亚、土耳其、中国等国，在我国新疆、山东、广西、江苏、浙江、陕西等地栽培也较为广泛。《本草纲目》[2]载：无花果“味甘、平、无毒，治五痔、咽喉痛”。《中药大辞典》[3]载：无花果“健胃清肠、消肿解毒，治肠炎、痢疾、喉痛、疮疖疥癣”。国内外研究表明无花果叶汁中含有20% 的白色胶状物、70% 的水分、9% 的蛋白酶和1%其他[4]。通过GC-MS分析方法分析出无花果叶汁中含有大量的多酚化合物、甾体类和香豆素类化合物，并具有抵制人类癌细胞的抗癌活性[5]，对自由基1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)有清除活性，对人黑素瘤细胞A375有光毒性[6]，对山羊疱疹病毒有体外抗病毒活性[7]，对单纯疱疹病毒(HSV-1)、艾柯病毒(ECV-11)和腺病毒(ADV)有抗病毒活性[8]。香豆素类化合物具有抗肿瘤活性[9-10]、抗真菌活性[11]、抗凝血作用[12]。

本研究对新疆阿图什无花果叶汁甲醇提取浸膏的化学成分进行了系统的研究，分离得到的主成分经波谱分析鉴定为伞形花内酯、佛手柑内酯、补骨脂素等香豆素类化合物。国内外尚未见对无花果叶汁中香豆素的定性、定量方面的系统研究。本研究通过HPLC法测定无花果叶汁中伞形花内酯、佛手柑内酯和补骨脂素在甲醇提取物中的含量，旨在为阿图什无花果叶汁药用价值的开发、研究及质量标准制定提供科学依据。

1仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱仪(e2695,Waters公司)，双波长检测器(2489型,Waters公司)，电子天平(LA12OS,Sartorius公司)，电热恒温干燥箱(DHG-9070A,上海齐欣科学仪器有限公司)，冷冻干燥仪(FDU-2100,东京理化器械株式会社)，旋转蒸发仪(SB-2000,上海爱明仪器有限公司)。

1.2试药无花果叶汁采收于新疆阿图什市松他克乡阿孜汗村无花果果园，冷冻，备用。色谱级甲醇(默克公司，德国)，色谱级乙腈(默克公司，德国)，水为超纯水。补骨脂素对照品(中国食品药品检定研究院，批号110739)，佛手柑内酯对照品(北京恒元启天化工技术研究院，批号14102708)，伞形花内酯对照品(北京恒元启天化工技术研究院，批号14120715)。

2方法与结果

2.1供试品溶液的制备将760 mL无花果叶汁用冷冻干燥仪冷冻干燥后，称重122.63 g，干燥后的白色粉末用甲醇浸提72 h，精密称取甲醇浸膏25.0 mg置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得浓度为5.0 mg/mL的甲醇提取溶液，作为供试品溶液。

2.2色谱条件色谱柱 Sunfire C18ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流速1 mL/min，检测波长为220 nm，柱温30℃，进样量为10 μL，流动相为乙腈-水，分离条件为：0~10 min，乙腈25%；10~12 min，乙腈由25%梯度增至50%；12~20 min，乙腈50%；20~22 min，乙腈由50%梯度增至100%，HPLC分析效果见图1。

1： 伞形花内酯； 2： 补骨脂素； 3： 佛手柑内酯

图13种香豆素对照品和无花果叶汁甲醇提取液HPLC分析图

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察分别精密称取伞形花内酯标准品0.1、0.3、0.7、1.1、1.5、1.9 mg置100 mL容量瓶中，加无水甲醇定容，摇匀，制成系列浓度标准溶液。分别精密称取佛手柑内酯和补骨脂素标准品各0.1、0.3、0.7、1.1、1.5、1.9 mg置10 mL容量瓶中，加无水甲醇定容，摇匀，制成系列浓度标准溶液。各标准溶液进样10 μL，以浓度C为横坐标(X)，峰面积A为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得到回归方程分别为：Y=3.273 3X-0.003 2(R2=0.999 9)、Y=7.426 3X-0.130 9(R2=0.999 7)、Y=5.839 3X-0.034 9(R2=0.999 9)，表明伞形花内酯进样量在0.001~0.019 mg/mL范围内、佛手柑内酯和补骨脂素进样量在0.01~0.19 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2精密度试验取伞形花内酯、佛手柑内酯和补骨脂素标准溶液，按“2.2”项下色谱条件进行HPLC分析，各标准品连续进样6次，以测定的峰面积为指标计算RSD值分别为1.76%、0.57%和0.63%，表明此方法精密度良好。

2.3.3稳定性试验精密称取甲醇提取浸膏25.0 mg，按“2.1”项下方法制备样品，按“2.2”项下色谱条件进行6次HPLC分析，时间间隔为0、2、4、8、16、24 h。以伞形花内酯、佛手柑内酯和补骨脂素的含量为指标计算RSD值分别为1.15%、0.98%和0.99%，说明24 h内样品稳定性良好。

2.3.4重复性试验称取甲醇提取浸膏6份，按“2.1”项下方法制备样品，按“2.2”项下色谱条件进行HPLC分析，测定含量。结果伞形花内酯、佛手柑内酯和补骨脂素的平均含量分别为1.06、10.50、27.18 mg/g，RSD值分别为1.61%、1.38%和1.09%。

2.3.5加样回收率试验精密称取已知伞形花内酯、佛手柑内酯和补骨脂素含量的甲醇提取浸膏各6份，对应加入伞形花内酯、佛手柑内酯和补骨脂素标准溶液适量，按“2.1”项下方法制备样品，按“2.2”项下色谱条件进行HPLC分析，测定含量，计算平均回收率分别为98.09%、102.07%和100.99%，RSD值分别为0.85%、1.07%和0.71%，见表1。

表1　无花果叶汁甲醇提取部位中3种香豆素的加样回收率试验计算结果

2.4样品含量测定分别精密称取25.0 mg甲醇浸膏3份，按“2.1”项下方法制备样品，按“2.2”项下色谱条件进行HPLC分析，分别记录3种香豆素的峰面积并用外标法[13]计算含量，结果阿图什无花果叶汁中伞形花内酯、佛手柑内酯和补骨脂素的含量分别为1.09、9.89、24.58 mg/g，见表2。

表2　无花果叶汁中3种香豆素的含量测定(n=3)

3讨论

3.1样品预处理方法无花果叶汁无使用钢刀具、未经挤压收集后，立即放入-20℃保存，备用。通过冷冻干燥仪除去水分，用无水甲醇浸提。

3.2测定波长选择无花果叶汁甲醇提取液通过二极管阵列检测器全波长扫描，确定香豆素类化合物220 nm处有最大吸收。本实验选定220 nm作为检测波长，在该波长下测定时，色谱峰对称，干扰少。

3.3流动相考察考察考察甲醇-水及乙腈-水作为流动相的效果，乙腈-水作流动相进行梯度洗脱时，杂质峰较少，峰形好，因此选用乙腈-水作为流动相。

本实验建立的高效液相色谱法测定阿图什无花果叶汁中3种香豆素的含量方法准确、灵敏、简便、快速，3种香豆素对照品有良好的线性关系，并且2种供试品溶液的重现性、精密度、稳定性、加样回收率均为良好。本研究结果可为深入开发阿图什无花果潜在的药用价值、利用及质量标准制定提供科学依据。

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(本文编辑施洋)

[收稿日期：2015-07-16]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.01.011

中图分类号：R914

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)01-0052-04