响应面法优化灵芝多糖的酶法提取工艺研究

朱 玲史吉平王晨光刘 莉*李保国1*周 靖

(1.上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093;2.中国科学院上海高等研究院,上海 201210;3.上海百信生物科技有限公司,上海 201401)

响应面法优化灵芝多糖的酶法提取工艺研究

朱 玲,史吉平2,王晨光3,刘 莉2,*,李保国1,*,周 靖3

(1.上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093;2.中国科学院上海高等研究院,上海 201210;3.上海百信生物科技有限公司,上海 201401)

以灵芝子实体粗多糖得率为考察指标,比较了不同种类酶对灵芝多糖的提取效果,筛选出能够提高灵芝多糖提取率的四种酶,即木瓜蛋白酶、破壁酶、纤维素酶和果胶酶;通过单因素和响应面优化实验确定了四种酶的复配方案和最佳酶用量,即木瓜蛋白酶1.6%、破壁酶2.1%、纤维素酶1.6%、果胶酶2.3%,在此基础上,以酶法提取过程中的四个重要参数温度、时间、pH和液固比为自变量,灵芝粗多糖得率为因变量,采用响应面优化设计的方法,研究了各自变量及其相互关系对粗多糖得率的影响,获得了最佳的酶解条件为:温度60 ℃,时间118 min,pH4.6,液固比16∶1,在此条件下粗多糖得率为4.41%,与传统水提法粗多糖得率3.12%相比,提高了41.3%。

响应面法,灵芝,多糖,酶法提取,子实体

灵芝(Ganodermalucidum),又名芝草、瑞草,是一种营养、保健价值极高的扇形或马蹄形大型担子菌[1]。现代医学研究表明,灵芝用于治疗肝、肾病,高血压,高血脂,神经衰弱,心血管疾病以及抗肿瘤等都有良好的临床疗效。灵芝作为日常生活的保健滋补品,备受人们青睐。而灵芝多糖是灵芝的主要活性成分之一,现已成为健康产业的研究热点。大量研究表明,灵芝多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、降血糖、降血脂和降血压等多种生物活性[2-6]。

工业上一般采用热水提取法[7-8]提取灵芝多糖,但这种方法存在提取得率低、提取温度高、效率低等诸多缺陷[9-11]。灵芝多糖存在于灵芝子实体的细胞壁内壁,除了灵芝多糖以外,子实体细胞壁还含有蛋白质、纤维素、半纤维、果胶和几丁质等物质,这些物质的存在都会影响多糖的提取[12]。

酶法是一种通过酶解破坏细胞结构来强化有效成分的传质过程,能最大限度提取中药有效成分的方法[13],已有研究表明,采用单一酶法[14-16]能够提高多糖的得率,同时两种不同种类的酶[17-18]复合提取灵芝多糖的研究也有报道,而且提取效果也优于单一酶法提取灵芝多糖,但多种酶协同作用于灵芝多糖提取的研究鲜有报道。

本研究以灵芝子实体为原料,利用复合酶法提取灵芝多糖,并用响应面[19]分析优化复合酶法提取灵芝多糖的最优工艺条件,以期提高灵芝多糖的得率,为酶法提取灵芝多糖的工业化生产和灵芝多糖的生物活性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灵芝子实体 龙芝二号,由上海百信生物科技有限公司提供,烘干粉碎过40目筛备用;溶菌酶(2万U/g)、破壁酶(5万U/g)、木瓜蛋白酶(80万U/g)、酸性蛋白酶(20万U/g)、碱性蛋白酶(20万U/g)、中性蛋白酶(20万U/g)和果胶酶(3万U/g) 均购于南宁庞博生物工程公司;木聚糖酶(20万U/g) 诺维信公司;纤维素酶(200万U/g) 尤特尔公司;无水乙醇、氢氧化钠、盐酸等均为分析纯 购于国药集团化学试剂有限公司。

高速离心机 日本Hitachi公司;水浴摇床 上海智城分析仪器制造有限公司;全自动新型鼓风干燥箱 上海智城分析仪器制造有限公司;旋转蒸发仪 德国IKA集团;真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 灵芝多糖的酶法提取工艺 灵芝子实体干粉5±0.01 g→加入蒸馏水100 mL→用盐酸和NaOH溶液调节至最适pH→加酶酶提(60 ℃,120 min,135 r/min)→煮沸灭酶(10 min)→第一次水提(100 ℃,120 min,135 r/min)→离心(10000 r/min,15 min)→沉淀第二次水提(100 ℃,60 min,150 r/min)→离心(10000 r/min,15 min)→滤液合并→旋蒸浓缩至原体积的四分之一(55 ℃,120 r/min)→4倍体积的无水乙醇醇沉→过滤得到滤渣→干燥(60 ℃干燥箱至恒重)→粗多糖。

在用水浴摇床对灵芝进行提取的过程中每隔15 min对三角瓶中的样液进行观察,防止灵芝样品不能完全浸没在液体中而不能得到充分的提取;热水提取法为去掉酶提部分。

1.2.2 酶的筛选 按照方法1.2.1,分别选用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、破壁酶、溶菌酶和纤维素酶,取酶量为灵芝子实体的1.5%,对灵芝子实体进行酶法提取多糖,计算粗多糖得率,以此为考察指标筛选提取效果较好的酶。

1.2.3 酶用量的单因素实验 参考张天笑[17],控制酶解pH为5.0,酶解温度60 ℃,酶解时间120 min不变,调节酶用量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,以粗多糖得率为考察指标,确定酶的最佳酶用量。

1.2.4 酶的复配及用量的响应面优化实验 根据酶用量的单因素实验结果,选择木瓜蛋白酶(A)、破壁酶(B)、纤维素酶(C)和果胶酶(D)为自变量,以粗多糖得率(Y)为响应值,根据Box-Benhnken的中心设计原理,进行四因素三水平响应面优化实验,利用Design Expert V8.05软件对数据进行分析,响应面实验的因素和水平见表1。

表1 酶的复配及用量响应面实验的因素和水平

1.2.5 酶解条件的响应面优化实验 参考贺寅[20],在确定了最佳酶的复配方案和酶用量基础上,选择酶解温度(A)、时间(B)、pH(C)和液固比(D)为自变量,以粗多糖得率(Y)为响应值,根据Box-Benhnken的中心设计原理,进行四因素三水平的酶解条件的响应面优化实验,利用Design Expert V8.05软件对数据进行分析,得到最适酶解条件。响应面实验的因素和水平见表2。

表2 酶解条件响应面实验的因素和水平

1.2.6 粗多糖得率的计算方法 灵芝粗多糖得率计算如式(1):

式(1)

式中:M为提取得到的粗多糖的质量;M0为样品的质量。

1.3 数据处理

实验数据采用Origin软件进行分析,ANOVA程序进行方差分析,当p<0.05时认为平均值有显著性差异,最小显著差异法用于数据多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 不同酶对灵芝粗多糖得率的影响

图2 酶用量对灵芝粗多糖得率的影响Fig.2 Influence of enzyme dosage on the crude polysaccharide yield

考察9种酶对灵芝多糖的提取效果,如图1所示。由图1可以看出:热水提取法中的灵芝粗多糖得率为3.12%;在所选择的4种蛋白酶中,木瓜蛋白酶中粗灵芝多糖的得率为3.35%,对灵芝多糖提取的效果最好,这可能与几种蛋白酶的作用位点不同有关;因为灵芝多糖存在于细胞壁里面,而细胞壁上有几丁质、果胶和纤维素等物质,分别添加破壁酶、纤维素酶和果胶酶后,这些酶能促进细胞壁的破裂,对灵芝多糖提取的会起到促进作用,添加这三种酶处理后,灵芝粗多糖得率分别为3.37%、3.34%和3.27%;而灵芝子实体细胞壁上没有能被溶菌酶和木聚糖酶催化分解的物质,这两种酶对灵芝子实体细胞壁的破碎没有起到作用,不能促进多糖的提取,提取的得率分别为3.12%和3.13%。因此选定木瓜蛋白酶、破壁酶、纤维素酶和果胶酶作为灵芝多糖提取的酶源。

图1 不同种类的酶对灵芝粗多糖得率的影响Fig.1 Influence of different kinds of enzymes on the crude polysaccharide yield

2.2 酶用量对粗灵芝多糖得率的影响

不同浓度的木瓜蛋白酶、破壁酶、纤维素酶和果胶酶对灵芝粗多糖得率的影响如图2所示,由图2可看出,随着酶用量的增大,粗灵芝多糖的得率随之增大,但酶用量增大到一定值之后,粗灵芝多糖的得率没有明显增高,说明酶浓度已经趋于饱和,从经济性考虑,确定四种酶的最佳用量分别为:木瓜蛋白酶1.5%、破壁酶2.0%、纤维素酶1.5%、果胶酶2.0%。

2.3 酶的复配及用量对灵芝多糖得率的影响

以灵芝多糖的得率(Y)为响应值,29个实验点由分析点和零点组成,其中分析点为自变量A、B、C、D的取值所构成的三位顶点,零点为区域中心点,其中零点实验重复5次以便估算实验误差响应面实验,结果见表3。

表3 酶的复配及用量的响应面实验设计及结果

利用Design Expert V8.05软件对表3中的实验数据进行多项式回归,得到粗多糖得率(Y)与木瓜蛋白酶(A)、破壁酶(B)、纤维素酶(C)、果胶酶(D)四个因素的二次多项回归方程为:

Y=-1.19692+1.44767A+0.55133B+2.41767C+1.18133D+4.8AB+0.02AC-0.06AD-0.22BC+1.12BD+0.08CD-0.72333A2-0.83533B2-0.68033C2-0.79033D2(R2=0.9352)

由表4方差分析表可知,一次项A(p=0.0050<0.01)、B(p=0.0098<0.01)和D(p<0.01)都极其显著,而C(0.01FA>FB>FC,即果胶酶>木瓜蛋白酶>破壁酶>纤维素酶。

为了考察木瓜蛋白酶、破壁酶、纤维素酶和果胶酶的交互作用对粗多糖得率的影响,采用Design Expert V8.05软件得到了交互作用显著的破壁酶和木瓜蛋白酶、交互作用极其显著的破壁酶和果胶酶的响应面图,由图3可知,灵芝多糖得率在木瓜蛋白酶用量为1.6%时达到最大,当木瓜蛋白酶的用量大于1.6%后,继续增加木瓜蛋白酶用量,灵芝粗多糖的得率反而下降,这可能是因为木瓜蛋白酶分子过饱和,一部分没有机会与底物结合,酶解效果变差;而随着破壁酶的增大,粗灵芝多糖的得率也随之增大,当破壁酶用量增大到2.0%左右时,灵芝多糖得率最高,继续增加酶用量,灵芝多糖得率开始下降,这可能是破壁酶过饱和时,破壁酶除了水解细胞壁上的几丁质,也对多糖起到了水解的作用。由图4可知,破壁酶和纤维素酶交互效应的响应面走势陡峭,表明两者交互作用对多糖提取率影响极其显著,而这也与方差分析的结果一致。

图3 木瓜蛋白酶与破壁酶交互作用对粗多糖得率的影响Fig.3 Influence of the interaction of papain and lyticase on the crude polysaccharide yield

图4 破壁酶与果胶酶交互作用对粗灵芝多糖得率的影响Fig.4 Influence of the interaction of lyticase and pectinase on the crude polysaccharide yield

表4 回归模型方差分析表

注:**表示极显著(p<0.0001),*表示显著(p<0.05);表6同。

表5 酶解条件响应面实验设计及结果

通过模型预测最佳酶用量为:木瓜蛋白酶1.6%、破壁酶2.1%、纤维素酶1.6%、果胶酶2.3%,在此酶用量下预测灵芝粗多糖得率为3.84%。对最佳酶用量条件进行实验验证,得到灵芝粗多糖得率为3.67%,与预测值相比,误差为4.42%。因此,优化得到的酶法提取灵芝多糖的酶的复配和用量有参考价值。

2.4 酶解条件对灵芝多糖得率的影响

在确定了最优酶的复配和用量的条件后,选择温度(A)、时间(B)、pH(C)、液固比(D)四个因素为自变量,以粗多糖得率(Y)为响应值,设计四因素三水平实验对灵芝多糖酶解提取条件进行优化,结果见表5。

利用Design-Expert V8.05软件对表5中实验数据进行多项式回归,得到粗多糖得率(Y)与温度(A)、时间(B)、pH(C)、液固比(D)四个因素的二次多项回归方程:

Y=-45.72+0.30A+0.37×B+4.89C+0.96D+0.0010AB-0.0153AC-0.0095AD+0.0004×BC+0.0006BD+0.0305CD-0.0015A2-0.0019B2-0.4949C2-0.0186D2(R2=0.9660)

表6 回归模型方差分析表

由表6方差分析结果表明,一次项B(p<0.01)影响极显著;C、D(p<0.05)影响显著;A(p>0.05)影响不显著;二次项B2、C2、D2、AD(p<0.01)影响极显著;AB、A2(p<0.05)影响显著;AC、BC、BD、CD(p>0.05)影响不显著。从方差分析表可知:FA=1.60,FB=61.82,FC=15.77,FD=21.92,各因素对粗多糖得率的影响顺序为:B>D>C>A,即时间>液固比>pH>温度。

图5为固定pH为5.0,液固比为20∶1得到交互作用显著的酶解温度和时间的响应面图,由图5可知,随着酶解时间的增加,多糖得率增大,当酶解时间增加到120 min后,继续延长酶解时间,粗多糖得率反而下降,这可能是时间过长,导致多糖分解;在图示的温度范围内,粗多糖的得率随温度的变化不大,这可能是选择的温度范围在复合酶的最适温度范围内,酶解温度的变化没有影响到酶的活性。图6为固定时间为100 min,pH为5.0得到的的酶解温度与液料比交互作用的响应面图,图形的走势极其陡峭,表明酶解温度与料液比交互作用显著,这也与方差分析的结果一致。

图5 酶解温度与时间交互作用对粗多糖得率的影响Fig.5 Influence of the interaction of enzymolysis hydrolysis temperature and time on the crude polysaccharide yield

图6 温度与料液比交互作用对粗多糖得率的影响Fig.6 Influence of the interaction of enzymolysis hydrolysis temperature and liquid to solid ratio on the crude polysaccharide yield

通过模型预测得到最佳酶解条件:温度60 ℃、时间118 min、pH4.6、液固比16∶1,在该条件下模型预测灵芝粗多糖得率为4.55%。为了验证模型的可靠性,对最优的条件进行了验证实验,灵芝粗多糖实际得率为4.41%,与理论预测值相比误差为2.86%。因此,采用响应面优化得到的酶法提取灵芝多糖的条件参数具有实用参考价值。

3 结论

本实验通过单因素和响应面实验优化,最终得到的酶法提取灵芝多糖的工艺条件为:a.酶及酶用量:木瓜蛋白酶1.6%、破壁酶2.1%、纤维素酶1.6%、果胶酶2.3%;b.最佳酶解条件:温度60 ℃,时间118 min,pH4.6,液固比16∶1。在此条件下灵芝粗多糖得率为4.41%,与传统的水提法粗多糖得率3.12%相比,提高了41.3%。可为复合酶法提取灵芝多糖的工业化生产提供理论依据。

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Optimization of enzymatic extraction of polysaccharides fromganodermalucidumusing response surface methodology

ZHU Ling1,SHI Ji-ping2,WANG Chen-guang3,LIU Li2,*,LI Bao-guo1,*,ZHOU Jing3

(1.School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China; 2.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China; 3.Shanghai Baixin Bio-Tech Co.,Ltd.,Shanghai 201401,China)

Effects of different kinds of enzymes on the extraction ofGanodermalucidumpolysaccharides have been investigated,with the crude polysaccharides yield fromGanodermalucidumfruit body as the index. The results showed that four enzymes,i.e.,papain,lyticase,cellulase,and pectinase,could increase the polysaccharides yield. The optimal combination and dosages of the four enzymes were determined by the single factor experiment method and the response surface methodology,which was papain 1.6%,lyticase 2.1%,cellulase 1.6%,and pectinase 2.3%,respectively. Then the response surface methodology was used again to determine the optimal enzymatic extraction conditions,with the temperature,time,pH value,and liquid to solid ratio as the variables,as well as the crude polysaccharides yield as the response. The optimal enzymatic extraction conditions were as follow:temperature 60 ℃,time 118 min,pH value 4.6,the liquid to solid ratio of 16∶1. Under these conditions,the crude polysaccharide yield was 4.41%,which was 41.3% higher than that of 3.12% extracted by traditional hot water extract method.

response surface methodology;Ganodermalucidum;polysaccharides;enzymatic extraction;fruit body

2016-07-07

朱玲(1992-)，男，硕士研究生，研究方向：食品科学与工程，E-mail：15921079038@163.com。

*通讯作者:刘莉(1982-)，女，博士，副研究员，研究方向：食品生物技术，E-mail: liul@sari.ac.cn。 李保国(1961-)，男，博士，教授，研究方向：食品和农产品加工新技术，E-mail:lbaoguo@126.com。

上海市农业科技成果转化项目(沪农科转字2015第2-2号)；中国科学院青年创新促进会专项经费项目(2015232)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000